铁皮石斛及其冻干粉对免疫抑制小鼠的免疫调节作用差异研究

张静　朱雅琴　祝宇龙

摘要  [目的]探讨铁皮石斛及其冻干粉对提升免疫抑制小鼠的免疫调节作用差异。[方法]120只SPF级昆明雄性小鼠分为空白对照组、环磷酰胺模型组、铁皮石斛组和铁皮石斛冻干粉组。两组给药组连续灌胃30 d后，24 h内模型组、铁皮石斛及其冻干粉组一次性腹腔注射200 mg/kg的环磷酰胺免疫抑制造模。试验结束后测定胸腺系数、脾脏系数、足趾肿胀度，以及血清中的细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的含量。[结果]铁皮石斛及其冻干粉均可以升高免疫抑制小鼠的胸腺和脾脏系数;增加免疫抑制小鼠的足趾肿胀度;上调免疫抑制小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6的水平。[结论]铁皮石斛及其冻干粉对环磷酰胺引起的免疫抑制具有明显的改善作用，且后者药效更好。

关键词  铁皮石斛;冻干粉;环磷酰胺;细胞因子;免疫调节

中图分类号  R285.5    文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2019）24-0180-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.054

Study on the Difference of Immunomodulatory Effects of Dendrobium officinale and Its Lyophilized Power on Immunosuppressed Mice

ZHANG Jing1，2，3，4，ZHU Ya-qin1，2，4，ZHU Yu-long1，2，4  （1.School of Pharmacy，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei，Anhui 230012;2.Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicine Formula，Hefei，Anhui 230012;3.Institute of Pharmaceutics，Anhui Academy of Chinese Medicine，Hefei，Anhui 230012;4.Synergetic Innovation Center of Anhui Authentic Chinese Medicine Quality Improvement，Hefei，Anhui 230012）

Abstract  [Objective]The research aimed to study the difference in immunomodulatory effects of Dendrobium officinale and its lyophilized power on immunosuppressed mice.[Method]120 SPF Kunming male mice were divided into control group，cyclophosphamide modle group，Dendrobium officinale and its lyophilized power group.Dendrobium officinale and its lyophilized power groups were continuously administrated for 30 days.At 24 hours before the end of the experiment，the model group，Dendrobium officinale and its lyophilized power group were intraperitoneally injected with 200 mg/kg cyclophosphamide.At the end of the experiment，the thymus index，spleen index，DTH，and serum cytokines IFN-γ，IL-2 and IL-6 were measured.[Result]Dendrobium officinale and its lyophilized power increased the thymus index，spleen index and toe swelling，up-regulated the levels of IFN-γ，IL-2 and IL-6 in the serum of immunosuppressed mice.[Conclusion]Dendrobium officinale and its lyophilized power has a significant improvement on the immunosuppression caused by cyclophosphamide，and the latter is better.

Key words  Dendrobium officinale;Lyophilized power;Cyclophosphamide;Cytokine;Immunoregulation

基金項目  安徽省科技重大专项（17030801015）。

作者简介  张静（1996—），女，安徽宿州人，硕士研究生，研究方向：药剂学。

收稿日期  2019-07-02

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属植物，位列中华九大仙草之首，是一种名贵的中草药。铁皮石斛中主要活性成分为多糖、生物碱、氨基酸、苄类及其衍生物、挥发性成分以及微量元素等[1-4]。铁皮石斛因其具有免疫调节作用、抗肿瘤和抗氧化等特性[5-7]，越来越受到现代医学的关注。而在实际应用中，铁皮石斛的应用人群往往是免疫力低下者。铁皮石斛冻干粉不仅最大限度地保留了铁皮石斛有效成分的生物活性和临床有效性，并且生物活性更高、临床有效性更好，更容易被人体消化吸收，能够更好地发挥药效。环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）属于烷化剂类免疫抑制剂，是可阻断复制，破坏DNA结构从而导致细胞死亡的一种细胞毒性化合物。因此为了探讨铁皮石斛及其冻干粉在增强免疫力功效方面的差异性，笔者采用CP建立免疫抑制动物模型[8]，通过比较铁皮石斛冻干粉和铁皮石斛免疫调节药效，为铁皮石斛冻干粉的药用价值提供依据，也为其深层次的开发和应用打下基础。

1  材料与方法

1.1  仪器  离心机（TG16-WS，常州市万丰仪器制造有限公司）;十万分之一电子天平（BT 25 S型，赛多利斯科学仪器北京有限公司）;酶标仪（RT-6000，雷杜生命科学有限公司）;恒温水浴锅。

1.2  试材

铁皮石斛购买于安徽亳州药材市场，由安徽中医药大学俞年军老师鉴定为兰科石斛属植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）的干燥根茎，铁皮石斛纯粉和铁皮石斛冻干粉是于安徽中医药大学药学院药剂实验室制得。环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司;ELISA试剂盒购于武汉基因美生物科技有限公司;绵羊红细胞（SRBC）、生理盐水等。

1.3  试验动物及分组处理

健康SPF级昆明雄性小鼠120只，来自安徽医科大学实验动物中心，生产许可证号为Scxk（皖）2017-001。小鼠随机分为4组（铁皮石斛原药材组、铁皮石斛冻干粉组、模型组和空白对照组），每组30只，铁皮石斛及其冻干粉按照《中华人民共和国药典》推荐量6～12 g的中间量9 g/（人·d）[0.15 g/（kg·d）]的10倍，即1.5 g/（kg·d）给药。空白对照组和模型组等剂量给予生理盐水，1.5 g铁皮石斛及其冻干粉加蒸馏水至100 mL，煎煮后水浴蒸发浓缩，灌胃。每日一次，连续30 d。试验结束前24 h，模型组、铁皮石斛及其冻干粉组一次性腹腔注射200 mg/kg的环磷酰胺[8-9]。

1.4  指标测定

1.4.1  免疫器官脏器系数。

末次给药24 h禁食不禁水后，精确称定小鼠体质量，4组每组10只小鼠摘眼球取血后处死，取小鼠胸腺和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，并称其质量，按照公式：脏器指数=脏器质量（mg）/体质量（10 g）来分别计算胸腺系数和脾脏系数。

1.4.2  迟发型变态反应（DTH）。

4组每组10只小鼠用2%绵羊红细胞（SRBC）0.2 mL腹腔注射致敏。致敏4 d后，测量左后足趾部厚度，并在该测量部位皮下注射20%的SRBC 20 μL，注射24 h后再重新测量左后足趾部厚度。用注射前后足趾厚度的差值（足趾肿胀度）来表示迟发型变态反应的程度。

1.4.3  血清中细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的含量。

末次给药24 h禁食不禁水后，每组10只小鼠摘眼球取血，室温静置30 min，3 000 r/min离心15 min，取上清，-80 ℃冰箱冻存备用。按照ELISA试剂盒说明书操作，检测血清中IFN-γ、IL-2和IL-6的含量。

1.5  数据统计分析

用Excel和SPSS软件进行数据分析处理，数据用±S表示。

2  结果与分析

2.1  铁皮石斛及其冻干粉对免疫抑制小鼠免疫器官脏器系数及迟发型变态反应（DTH）的影响

由表1可见，与空白对照组相比，模型组小鼠的脾脏系数、胸腺系数和足趾肿胀系数都有极为显著的统计学意义（P<0.01）;铁皮石斛冻干粉组与环磷酰胺模型组相比有显著的统计学差异（P<0.05）;铁皮石斛组与模型組相比仅有统计学差异（P<0.05）。

2.2  血清中细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的含量

由表2可见，与空白对照组相比，模型组小鼠的细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6有显著性差异（P<0.01）。铁皮石斛冻干粉组与铁皮石斛组相比，小鼠血清中IFN-γ、IL-2和IL-6水平增加，铁皮石斛冻干粉组与模型组相比有显著性差异（P<0.01）;铁皮石斛组与模型组相比细胞因子IFN-γ和IL-6有显著性差异（P<0.01），而因子IL-2有统计学差异（P<0.05）。

3  讨论

天然植物多糖被认为是最有前途的免疫调节剂，相对无毒且没有明显的副作用。铁皮石斛经常以水提取物的方式服用，其中发挥最大药效的成分是石斛多糖。植物多糖可诱导如TNF-α、IL-1h、IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ和IFN-β细胞因子的产生[10]。该研究中通过煎煮铁皮石斛及其冻干粉的浓缩液灌胃给药，腹腔注射环磷酰胺后，结果显示模型组小鼠的免疫器官脏器系数、足趾肿胀度和血清中IFN-γ、IL-2、IL-6均降低，表明免疫抑制模型建立成功。而灌胃给予铁皮石斛及其冻干粉后，各个指标数均明显升高，表明铁皮石斛及其冻干粉具有增强免疫力的作用，且尤以铁皮石斛冻干粉的疗效更加显著。

该研究发现铁皮石斛具有增强免疫力的作用，其作用机制可能与上调细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6等的表达水平有关。但是机体免疫调节系统是一个极其复杂的系统，目前对石斛尤其是铁皮石斛及其冻干粉的研究依然处于比较浅显的阶段，其具体机制还有待进一步的深入研究。

参考文献

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