不同浓度钼酸钠对白肋烟苗期碳氮代谢和硝酸盐含量的影响

冯雨晴，李亚飞，2，史宏志*，周 骏，白若石，马雁军，林淑贞

1. 河南农业大学烟草学院烟草行业烟草栽培重点实验室 烟草农业减害研究中心，郑州市金水区文化路95 号 450002

2. 河南经贸职业学院，郑州市郑东新区龙子湖北路58 号 450018

3. 上海烟草集团有限责任公司北京卷烟厂，北京市通州区万盛南街99 号 100024

白肋烟烟叶产量、品质和安全性对卷烟品质有较大影响。Lewis 等［1］研究表明，白肋烟Yb 基因突变导致其烟叶色素含量低，光合作用弱，含碳化合物含量低，易出现烟叶硝酸盐大量积累和氮素利用率低等问题［2-3］。烟草叶片中的硝酸盐是烟叶和烟气中烟草特有亚硝胺（TSNAs）的重要前体物，且烟叶硝酸盐含量与TSNAs 积累呈显著直线相关关系［4-6］。因此，减少烟叶中硝酸盐积累量对降低烟叶TSNAs 形成和提高卷烟安全性具有重要意义。有研究表明，烟叶硝酸盐含量与碳氮代谢密切相关［7-8］，氮还原同化能力弱和物质能量供应不足是引起白肋烟烟叶硝酸盐积累的主要原因［9］。可见，提高烟叶光合碳固定和氮同化能力是降低烟叶硝酸盐含量的重要途径。

钼素（Mo）是烟草生长必需的微量元素，且钼是醛氧化酶、亚硫酸盐氧化酶、黄嘌呤脱氢酶等的组成成分，能促进植物色素合成，对烟草氮素营养吸收及提高烟叶叶绿素含量和稳定性、增强光合能力、促进碳水化合物合成转移和提高作物产量等有重要作用［10-12］。硝酸还原酶（NR）是一种水溶性钼黄蛋白，参与硝态氮还原为氨的过程，且有利于蛋白质合成，而钼素作为NR 的必须组分，直接影响NR 活性。因此，钼在氮代谢过程中起着核心作用［13-14］。植物缺钼症状与缺氮症状较为相似，推测是由于缺钼导致NR 活性丧失，造成氮素还原作用异常，氮素同化作用受影响，进而呈现出类似缺氮的症状［15-16］。施钼可提高烤烟生长发育中前期叶绿素含量，增加光合速率，从而促进光合产物的形成，提高烟叶产量［17-19］。同时，施钼对植物叶片NR 有激活作用，能促进植物氮代谢，降低植物体内硝酸盐含量，提高氮肥利用效率［20-21］。烟草中钼是通过土壤以钼酸根离子的形式被根系吸收利用，而通过叶面喷施烟草叶片也可以吸收钼，且比根系吸收更快［17］。李亚飞等［22］研究表明，施用钼酸铵能提高烤烟烟叶NR 活性，促进蛋白质合成；秦亚光等［23］研究发现，在一定范围内，随着施钼量的增加，烤烟硝酸盐含量降低；廖晓勇等［24］研究提出，施钼对烟草农艺性状的各项指标均有促进作用；崔国明等［12］试验认为，烤烟施Mo 能促进烟株生长，协调烟株生理代谢，增加烟叶产量和产值，改善烟叶品质。同时，国外的一些研究也表明，Mo 在植物氮素代谢过程中扮演着重要的角色，参与植物体的生物固氮、硝酸盐还原以及含氮化合物运输等［25-27］。在豆科植物和非豆科植物中，施钼可提高大豆、水稻和大麦的硝酸还原酶活性，促进氮代谢，降低植株硝酸盐含量，进而提高氮肥利用率［28-30］。Elrys 等［31］研究表明，施用钼浓度100 mg/L 时马铃薯块茎中硝酸盐含量显著降低。可见，目前有关钼对烤烟和植物生长和品质影响的研究已有报道，但钼对白肋烟苗期生物量积累和碳氮代谢影响的研究却鲜有涉及。为此，设置了不同钼酸钠浓度喷施试验，旨在明确钼酸钠对白肋烟色素含量、光合作用、氮素还原同化作用、硝酸盐含量和碳氮化合物协调性的影响，并筛选出白肋烟苗期钼酸钠的适宜施用浓度，为白肋烟减害和烟叶品质的提高提供依据。

1 材料与方法

1.1 烟苗培育

试验于2017 年4 月在国家烟草生理生化研究基地人工气候室内进行。气候室条件设置：温度22～28 ℃，每12 h昼夜光暗交替（白天时间段设置为7：00—19：00），光照强度800 μmol·m-2·s-1，相对湿度85%。供试白肋烟品种为TN90，在人工气候室内采用漂浮育苗，烟草种子用2%次氯酸钠溶液消毒2次，每次5 min，随后将其播种在填满基质的200 孔育苗盘中。浮盘规格：长78 cm，宽38 cm，高5.5 cm，每盘200孔。育苗框规格：长82 cm，宽45 cm，高20 cm，每框1 个浮盘，育苗时在框中加入10 L 清水，待烟苗长至大十字期时开始加入Hoagland 营养液［8］。待烟苗长至4～5 片真叶（苗龄40 d 左右）时，选取长势均匀一致的壮苗，用去离子水将根系冲洗干净后，移栽至小花盆中（规格7.1 cm×6.7 cm×7.8 cm），每盆1 株，烟苗长至七叶一心时进行喷施处理。每处理选取10 株长势均匀一致的烟苗，共计50株。用清水和不同浓度钼酸钠溶液于每天17：00时对烟苗叶片正反面进行喷施，至叶片上液滴均匀且欲下滴时为止，连续喷施3 d，最后1 次喷施后间隔7 d 取样测定。

1.2 试验处理

试验采用单因素随机区组设计，设置5个处理，即处理1 为清水对照（CK）；处理2 为0.1%钼酸钠；处理3 为0.5%钼酸钠；处理4 为1.0%钼酸钠；处理5 为2.0%钼酸钠。每处理设置3 次生物学重复。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 样品处理

在最后一次喷施后7 d 取样并进行相关生理指标的测定。将各处理烟苗平均分成两份，分别用于新鲜样品检测和杀青样品保存。样品分组后，将各处理烟苗的根、茎、叶分离，用去离子水清洗干净，并用吸水纸吸干后进行测定和样本保存。

新鲜样本用于烟叶色素含量（质量分数）、硝酸还原酶活性（NRA）和可溶性蛋白质含量（质量分数）测定。杀青样品的制作方法：将各处理样品叶片清洁干净后，放入烘箱中于105 ℃杀青20 min，60 ℃烘干至恒质量，称量，磨碎，过0.3 mm（60目）筛，用于烟叶干物质积累量、含量和常规化学成分含量（质量分数）的测定。

1.3.2 烟草光合速率的测定

选取各处理长势均匀一致的烟苗，采用便携式光合测定仪（LI-6400，美国Licor 公司）测定光合速率。该仪器为开放式气路，红蓝光源，光照强度为800 μmol·m-2·s-1，测定时间为8：30—10：00，测定对象为烟苗最大功能叶（从下向上数，第3 叶位）［32］。每处理重复测定3 次。

1.3.3 烟叶NRA、色素和可溶性蛋白质含量的测定

选取各处理长势均匀一致的烟苗，选择最大功能叶的6～8 支脉（位于叶尖与叶基中部）之间叶肉，用剪刀剪成2 mm × 5 mm 条状，混匀后用于烟叶NRA、可溶性蛋白含量、色素含量的测定，每处理数据为3 次重复的平均值。采用95%乙醇提取法测定色素含量，采用活体法测定NR 活性，采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量［14］。

1.3.4 总氮、总糖和还原糖含量的测定

采用浓H2SO4水杨酸法测定烟叶含量［33］。烟叶总氮、总糖和还原糖含量按照烟草行业标准［34-35］用连续流动分析仪（AA3，德国BRAN+LUEBBE 公司）检测。

烟叶氮素积累量和氮素利用效率的计算：

氮素积累量（mg/株）=烟叶总氮含量（%，g/100 g）×烟叶干质量（g/株）×1 000

氮素利用效率（NUE，mg DW/mg N）=烟叶干物质量/烟叶氮素积累量

1.4 数据处理

采用Excel 2016 和Origin pro 9.0 软件进行数据分析和制图；使用SPSS 17.0 软件进行方差分析，用LSD 法对烟叶干物质积累量、色素含量、NRA、总氮和氮素积累量等指标进行方差分析和方差齐性检验。

2 结果与分析

2.1 不同浓度钼酸钠处理对烟叶干物质积累的影响

由图1 可知，在0.1%～2.0%浓度范围内，施用钼酸钠后烟叶干物质积累均呈增加趋势，且随钼酸钠浓度增加烟叶干物质积累呈升高趋势。其中，0.1%、0.5%、1.0%和2.0%钼酸钠处理后，烟叶干物质积累量较对照分别提高7.83%、16.87%、30.72%和30.12%，其中1.0%和2.0%钼酸钠处理效果最佳。这说明施用1.0%和2.0%钼酸钠对增加烟叶干物质积累和培育壮苗有积极作用。

图1 不同浓度钼酸钠处理烟叶干物质积累量的比较Fig.1 Comparison of dry matter accumulation among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.2 不同浓度钼酸钠处理对烟叶色素含量和光合速率的影响

叶绿素是参与植物叶绿体内光合作用的重要色素，能够捕捉光能并将光能转化为化学能，对烟草的生长发育及产量和品质形成均具有重要作用［36］。由图2 可知，在0.1%～2.0%浓度范围内，施用不同浓度钼酸钠后，烟叶色素含量和光合速率均呈现出升高趋势；在0.1%、0.5%、1.0%和2.0%钼酸钠处理后烟叶色素含量较对照分别提高1.13%、2.55%、4.25%和3.40%，其中喷施1.0%钼酸钠后，烟叶色素含量明显高于对照，且差异达到显著水平；烟叶光合速率分别较对照提高0.85%、3.70%、12.81%和12.15%，其中，1.0%和2.0%钼酸钠处理后，烟叶光合速率与对照间差异均达到显著水平。本试验中，在0.1%～1.0%钼酸钠范围内，烟草色素含量和光合速率均随钼酸钠浓度增加而呈现出升高趋势，但在钼酸钠浓度大于1.0%时烟叶色素含量和光合速率相对稳定，且保持在较高水平，即烟叶光合速率在2.0%钼酸钠和1.0%钼酸钠处理间差异不显著。

图2 不同浓度钼酸钠处理烟叶光合速率和色素含量的比较Fig.2 Comparison of photosynthetic rate and pigment content among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.3 不同浓度钼酸钠处理对烟叶总糖和还原糖含量的影响

烟叶中的总糖和还原糖是重要碳水化合物，为烟株氮代谢活动提供能量物质和碳骨架，对烟株生长发育有重要影响［8］。由图3 可知，在0.1%～2.0%浓度范围内，喷施钼酸钠后，烟叶总糖含量变化不大，但烟叶还原糖含量与对照间差异达到显著或极显著水平；在0.1%～2.0%浓度范围内，随着施用钼酸钠浓度的增加，烟叶还原糖含量呈现出升高趋势，其中在钼酸钠浓度为0.5%、1.0%和2.0%时，烟叶还原糖含量较对照分别增加19.69%、23.38%和22.46%。可见，喷施钼酸钠能够提高烟苗碳同化能力，促进碳水化合物合成，为烟草中还原同化和其他代谢过程提供充足碳源，这有利于降低烟叶硝酸盐含量和提高烟叶产量［8］。

2.4 不同浓度钼酸钠处理对烟叶酶活性的影响

图3 不同浓度钼酸钠处理烟叶总糖和还原糖含量的比较Fig.3 Comparison of total sugar and reducing sugar contents among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

NR 是植物体硝酸盐代谢途径中的限速酶，具有将硝酸盐还原成为亚硝酸盐的作用［32］。钼是NR 的重要组分，增施钼肥能够提高作物NRA，对促进烟株的同化利用有积极作用，对降低烟株体内硝酸盐含量和提高氮肥利用效率均有良好效果［10］。由图4 可知，烟叶NRA 随着钼酸钠浓度增加而呈现出升高趋势。其中，施用钼酸钠浓度为0.5%、1.0%和2.0%时，烟叶NRA较对照分别提高16.87%、30.72%和30.12%，差异均达到极显著水平。施用2.0%钼酸钠后，烟叶NRA 与钼酸钠浓度为1.0%时差异不大，说明钼酸钠能促进苗期白肋烟NRA 的提高，且浓度为1.0%时效果最佳。

图4 不同浓度钼酸钠处理烟叶硝酸还原酶活性的比较Fig.4 Comparison of nitrate reductase activity among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.5 不同浓度钼酸钠处理对烟叶可溶性蛋白含量的影响

叶片中可溶性蛋白不仅参与了植物器官的建成，而且很大一部分蛋白是具有调控生理生化反应活性的酶类物质，其含量可以反映植物的代谢强度［37］。由图5 可知，在0.1%～2.0%浓度范围内，随着钼酸钠浓度的增加，烟叶可溶性蛋白含量呈现出升高趋势，说明施用钼酸钠能促进氮素同化作用，有利于烟叶可溶性蛋白的形成。其中，在钼酸钠为1.0%和2.0%时，烟叶可溶性蛋白含量较对照分别提高18.43%和17.84%，差异达到极显著水平，且钼酸钠浓度为1.0%和2.0%时，烟叶可溶性蛋白含量差异不大。由此可见，在0.1%～2.0%浓度范围内，1.0%钼酸钠浓度对提高烟叶可溶性蛋白含量的作用效果最佳。

图5 不同浓度钼酸钠处理烟叶可溶性蛋白含量的比较Fig.5 Comparison of soluble protein content among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.6 不同浓度钼酸钠处理对烟叶总氮含量和氮素积累量的影响

由图6 可知，在0.1%～2.0%浓度范围内，烟叶总氮含量随钼酸钠浓度的增加呈现出下降趋势，其中在钼酸钠浓度为1.0%和2.0%时，烟叶总氮含量较对照分别降低10.76%和10.57%，差异达到显著水平。在0.1%～2.0%浓度范围内，烟叶氮素积累量随钼酸钠浓度增加而呈现出升高趋势，其中在0.1%、0.5%、1.0%和2.0%钼酸钠处理时，烟叶氮素积累量较对照分别提高3.50%、7.44%、16.59%和16.37%。喷施1.0%钼酸钠的烟叶总氮含量下降10.76%，烟叶氮素积累量提高16.59%，说明喷施钼酸钠能增加烟叶干物质积累量，从而使烟叶氮素积累量呈现增加趋势。原因可能是由于钼酸钠处理能促进烟草干物质积累，从而对总氮含量产生稀释效应，最终导致烟叶总氮含量下降。另一方面也表明，喷施钼酸钠能促进烟株的碳氮代谢，对增加烟叶干物质积累量和降低硝酸盐含量有积极作用。

图6 不同钼酸钠浓度处理烟叶总氮含量和氮素积累量的比较Fig.6 Comparison of total nitrogen content and nitrogen accumulation among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.7 不同浓度钼酸钠处理对烟叶 含量和硝态氮/总氮（-N/TN）的影响

图7 钼酸钠处理烟叶和的比较Fig.7 Comparison of content and content/total nitrogen content among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.8 不同浓度钼酸钠处理对烟叶氮素利用效率的影响

由图8 可知，喷施不同浓度钼酸钠均能提高烟叶氮素利用效率，且差异达到显著或极显著水平。与对照相比，钼酸钠浓度为1.0%和2.0%时，烟叶氮素利用效率分别提高12.42%和10.92%，与钼酸钠能促进烟叶干物质积累，提高烟草氮代谢能力有关。

图8 钼酸钠处理烟叶氮素利用效率的比较Fig.8 Comparison of nitrogen use efficiency among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

3 讨论

NR 是高等植物氮同化过程中的关键限速酶，可直接调节硝酸盐的还原，从而调节氮代谢，并影响光合碳代谢［38］。Mo 作为NR 的主要组成成分，参与植物的氮代谢和碳代谢过程［39］。本试验条件下，喷施不同浓度钼酸钠能不同程度地提高烟叶色素含量和光合速率，与刘利［40］和张纪利等［41］在草莓和烤烟上的研究结果一致。其中在钼酸钠浓度为1.0%时，烟叶还原糖含量和干物质积累量显著提高，与色素和光合作用指标的试验结果一致，而总糖含量与对照间差异不大，与崔国明等［12］和张纪利等［41］的研究结果有所不同，可能是因为钼酸钠处理对烟叶总糖和还原糖含量的影响有时间效应，烟草生长前期钼酸钠处理能促进光合作用直接产物（葡萄糖、果糖等还原性糖）的生成，而对总糖（淀粉等）的影响相对滞后。这说明钼酸钠处理能够提高烟草光合作用能力，促进光合产物的积累，可能与钼能提高作物叶绿素结构的稳定性有关［42］，而钼酸钠参与植物体光合作用的机制尚不清楚，有待进一步研究。此外，喷施不同浓度钼酸钠均能提高烟叶NRA 和可溶性蛋白质含量，其中钼酸钠浓度为1.0%和2.0%时，烟叶硝酸盐含量显著降低，NRA 显著提高，同时，在该处理条件下烟草可溶性蛋白质含量显著提高，表明该处理条件下有更多的被吸收利用。钼酸钠可以通过提高NR 活性，增强氮素还原同化能力，从而降低烟叶硝酸盐积累量，与赵静等［21］、崔国明等［12］研究结果一致。本试验结果中，喷施不同浓度钼酸钠能提高烟叶氮素积累量和烟叶干物质积累量，可能是由于钼酸钠提高氮同化能力，进而增强碳同化能力，促进光合产物的积累和植株的生长，其作用机制还有待进一步深入探索。值得关注的是，白肋烟需氮量高，氮利用效率低，而钼酸钠的施用能提高烟叶氮素利用效率，进而减少氮肥施用，对优质低危害烟叶的生产和可持续发展具有重要意义。本试验中，钼酸钠浓度为1.0%时对苗期白肋烟烟叶总体效果较好，最佳剂量能否作为田间的最佳施用量，有待进一步大田试验验证。

4 结论

在温度22～28 ℃，光照强度800 μmol·m-2·s-1，相对湿度85%，每12 h 昼夜光照交替的人工气候室条件下，白肋烟烟苗施用0.1%～2.0%浓度钼酸钠后，烟叶色素含量、光合速率、两糖含量、NRA 和可溶性蛋白含量、烟叶干物质积累量均增加，烟叶氮素利用效率明显提高，且硝酸盐含量显著降低。钼酸钠处理能提高白肋烟烟叶氮素还原同化能力和碳同化能力，促进光合产物的积累，从而促进硝酸盐还原同化过程，有利于降低烟叶硝酸盐含量，在白肋烟苗期以1.0%钼酸钠处理效果最佳。