改良联合酶消化法制备人瘢痕疙瘩组织单细胞悬液的实验研究

黄昕 徐祥文 高雅姗 李海洲 顾舒晨 邝依敏 昝涛

瘢痕疙瘩是继发于皮肤外伤或自发形成和过度生长的病理性瘢痕组织，由于瘢痕疙瘩的发病机制尚未完全阐明，因此临床治疗难度较大[1]。目前认为，瘢痕疙瘩的形成是以成纤维细胞功能紊乱为主、多种微环境细胞共同参与的复杂过程[2]。近年来，细胞流式技术和单细胞组学技术的发展使人们能够从单细胞层面，以基因组、转录组、代谢组以及蛋白组等多个角度，对复杂的细胞群体进行精细的鉴定和分析[3]。在皮肤研究领域，单细胞组学技术的应用进一步明确了皮肤中的细胞亚群[4-6]，及其在衰老[7]、创面愈合[8]等方面的生理和病理学机制。上述研究提示，从单细胞水平对瘢痕疙瘩组织中的细胞亚群和细胞功能变化规律进行研究，可以进一步揭示瘢痕疙瘩的发病机制。

将组织制备成单细胞悬液是单细胞研究的关键环节。但是，瘢痕疙瘩组织质地坚硬，真皮层有大量致密的胶原沉积[9]，消化难度大。通常，瘢痕疙瘩组织的消化采用的是以胶原酶为主的酶消化法[10-12]，但是前期报道的酶消化法主要用于提取组织中的原代成纤维细胞，消化得到的细胞悬液中含有大量细胞团块，未能达到单细胞悬液制备的要求。近期，有研究报道采用联合酶消化法制备真皮组织的单细胞悬液，获得了较好的消化效果，但是并未尝试用于瘢痕疙瘩组织的消化[6，13]。

本文对传统联合酶消化法进行改进，探讨改良联合酶消化法对于瘢痕疙瘩真皮组织的消化效果，包括组织消化获得的单细胞比例、单细胞数量以及细胞活性，并探究达到最佳消化效果需要的消化时间，为制备瘢痕疙瘩组织的单细胞悬液提供新方法。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

DMEM 高糖培养基、Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶（Gibco 公司，美国），透明质酸酶、DNaseⅠ（Sigma 公司，美国）、中性蛋白酶（Roche，瑞士），Masson 组织染色试剂盒（南京建成科技有限公司），台盼蓝染色液、红细胞裂解液（Biosharp，中国），流式细胞染色缓冲液、PI 染料（BD 公司，美国）。

超净工作台、倒置相差显微镜（Nikon 公司，日本）、流式细胞分析仪（LSRFortessa X-20，BD 公司，美国）。

1.2 瘢痕疙瘩组织的保存和Masson 染色

收集手术切除后废弃的瘢痕疙瘩组织样本8 例（获我院转化医学伦理审查专委会审议通过，批件号：2018-129-T107），剪成0.5 cm×0.5 cm 大小保存于4%多聚甲醛中，48 h 后常规石蜡包埋，横断面4 μm 厚连续切片，行Masson 染色。其余样本浸泡于含有5%双抗的组织保存液中，1 h 后进行组织消化。Masson 染色根据说明书进行：组织切片经过脱蜡、复水后核染液染色60 sec，PBS 水洗30 sec，浆染液染色60 sec，PBS 水洗30 sec，黄色分色液分色6 min，蓝色复染液染色5 min，无水乙醇冲洗，风干后封片。

1.3 实验分组和消化酶的配制

将8 例瘢痕疙瘩组织从组织保存液中取出，浸没于75%乙醇溶液中30 sec，取出后PBS 充分清洗3 次。将组织切成5 mm×5 mm 大小，加入0.3%中性蛋白酶消化液，液体体积为组织体积的2 倍，置于37 ℃摇床100 r/min 消化1 h。撕去表皮，将真皮组织用剪刀匀浆。

本实验分为两部分进行。第一部分实验对比A、B 两种方案（A、B 组）的消化效率。在该部分实验中，取3 例样本，每例样本取两份500 μL 的真皮组织匀浆，分别用A、B 方案在37 ℃摇床（100 r/min）上消化2 h、4 h。第二部分实验进一步确定B 方案达到最佳消化效果需要的消化时间。在该部分实验中，取5 例样本，每例样本取500 μL 的真皮组织匀浆，用B 方案在37 ℃摇床（100 r/min）上消化4 h、6 h、8 h和10 h。消化完成后，用40 μm 的滤网过滤消化液，1 000 r/min 离心8 min，弃上清。细胞沉淀中加入500 μL 的红细胞裂解液，室温裂解2 min 后加入5 mL 的PBS 中和裂解，1 000 r/min 离心8 min，弃上清。细胞沉淀中加入200 μL 流式细胞染色缓冲液重悬。

A 方案为传统联合酶消化法，配制方法：DMEM高糖培养基中加入1.25 mg/mL Ⅰ型胶原酶，0.5 mg/mLⅡ型胶原酶，0.5 mg/mL Ⅳ型胶原酶，0.1 mg/mL 透明质酸酶，1% 双抗。B 方案采用改良联合酶消化法，即在A 方案的基础上添加0.1 mg/mL DNaseⅠ。

1.4 单细胞比例和单细胞数的计算

取10 μL 细胞悬液滴于细胞计数板，用倒置相差显微镜拍照记录组织消化情况。计数消化得到的单细胞数，并计算单细胞比例。单细胞数=细胞浓度（cells/mL）×0.2 mL。单细胞比例=[单细胞数/（单细胞数+细胞团数）]×100%。

1.5 细胞活性的检测

1.5.1 台盼蓝染色计数细胞成活率

取10 μL 细胞悬液，与0.2%的台盼蓝染液1∶1混合，室温下放置2 min，将混合液滴于细胞计数板，对台盼蓝染色阳性的死细胞和染色阴性的活细胞进行计数，细胞成活率=[活细胞数/（活细胞数+死细胞数）]×100%。

1.5.2 流式细胞学检测细胞活性

取100 μL 细胞悬液，在其中加入1 μL 的PI 染料，吹打混匀，室温孵育1 min 后进行流式细胞检测。活细胞不能被PI 染料染色，死细胞的细胞膜会出现破损，PI 染料与细胞核内的染色体结合，发出荧光。用Flowjo 软件对数据进一步分析和绘图。

1.6 统计学分析

采用Graphpad prism 6 软件进行数据的统计分析和绘图，所有计量资料以（）表示。B 组消化方案消化4 h、6 h、8 h 和10 h 的结果采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey 法。A 组和B 组消化2 h、4 h 的结果用双因素方差分析，两两比较采用Sidak法。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘢痕疙瘩的组织学特征

Masson 染色显示瘢痕疙瘩组织最为特征性的改变是真皮深层细胞增生活跃、胶原高度沉积的增生结节区，该区胶原纤维排列紊乱，形成粗大的纤维条索和结节。这提示在制备单细胞悬液的过程中，需要大量降解胶原成分的酶，以释放包裹于致密细胞外基质中的细胞（图1）。

图1 瘢痕疙瘩组织Masson 染色（PD：真皮乳头层；RD：真皮网状层；标尺：10 μm）Fig.1 Masson staining of keloid tissue (PD:papillary dermis;RD:reticular dermis;Scale bar:10 μm)

2.2 A 组和B 组消化效率的比较

消化2 h 后对细胞悬液进行镜检发现，A 组和B 组仍有大量组织团块残留，消化不充分，单细胞比例和单细胞数量较少。当消化时间延长至4 h，消化得到的单细胞数和单细胞比例明显提高。其中，B 组消化得到的单细胞比例（71.87%±4.88% &59.67%±2.62%，P＜0.05）和单细胞数（4.34×105±0.26×105&2.60×105±0.56×105，P＜0.01）显著高于A 组，提示通过添加DNaseⅠ，可有效提高组织消化效率（图2）。

2.3 B 组消化不同时长的组织消化效果

2.3.1 不同消化时长的单细胞比例和单细胞数

对采用B 方案消化不同时长的细胞悬液进行镜检发现，消化6 h、8 h 和10 h 时的组织消化程度优于4 h，视野内细胞团块数明显减小。消化6 h获得单细胞比例（84.4%±5.78% &62.40%±6.04%，P＜0.01）和单细胞数（11.16×105±0.90×105&4.60×105±0.78×105，P＜0.01）相较消化4 h 显著升高。延长消化时间至8 h和10 h，单细胞比例相比消化6 h 有所升高，但差异不明显（P＞0.05），提示消化6 h 基本能够获得组织的充分消化；而消化8 h 和10 h 获得的单细胞数相较消化6 h 略微降低，没有显著性差异（P＞0.05），可能是消化时间过长导致细胞损伤和破裂（图3）。

2.3.2 不同消化时长得到的细胞活性

台盼蓝染色检测细胞悬液中的细胞活性可以发现，消化6 h 获得的活细胞率比4 h 有所下降，但差异不明显（86.12%±3.32% &88.51%±3.89%，P＞0.05）。当消化时间延长到8 h 和10 h，细胞活性比消化6 h显著降低（77.02%±3.62% &86.12%±3.32%，P＜0.01；68.24%±5.92% &86.12%±3.32%，P＜0.01）。通过计算PI 染色阴性细胞所占的比例确定活细胞率，同样发现消化6 h 与消化4 h 获得的活细胞率无统计学差异（83.66%±2.95%&88.42%±2.95%，P＞0.05）。当消化时间延长到8 h 和10 h，活细胞比例相比消化6 h显著降低（73.56%±3.72% &83.66%±2.95%，P＜0.05；58.92%±6.21% &83.66%±2.95%，P＜0.01）（图4）。

图2 A 组与B 组消化2 h 和4 h 的组织消化效果Fig.2 Results of tissue digestion after 2 hours and 4 hours digestion in group A and group B

图3 B 组消化4 h、6 h、8 h 和10 h 的组织消化效果Fig.3 Results of tissue digestion after 4 hours,6 hours,8 hours and 10 hours digestion in group B

图4 B 组消化4 h、6 h、8 h 和10 h 的细胞活性Fig.4 Cell viability after 4 hours,6 hours,8 hours and 10 hours digestion in group B

3 讨论

目前，皮肤组织的消化没有固定的方案，最为常用的是酶消化法。中性蛋白酶能有效降解细胞和细胞外基质间的连接蛋白，对细胞间连接和细胞本身几乎不造成影响，故常被用于表皮和真皮的分离[14]。胶原是真皮组织中主要的细胞外基质成分。因此，真皮组织的消化主要依赖各种类型的胶原酶。其中，有采用单一类型的胶原酶（如Ⅰ型胶原酶[10]或Ⅳ型胶原酶[11]）对瘢痕疙瘩组织进行消化，也有使用粗制的混合胶原酶[12]（包含Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶等）进行消化。但是，由于其目的在于提取成纤维细胞，因而在单细胞比例上没有明确要求，消化得到的细胞悬液中包含大量细胞团块，无法达到单细胞悬液的制备要求。近年来，随着单细胞检测技术的兴起，人们对真皮组织的消化程度提出了更高的要求。相继有研究报道了正常皮肤单细胞悬液的制备方法，能够满足常规流式细胞检测和单细胞测序的要求[4-6，13]。其中主要的消化方式分为两种：一种是皮肤消化试剂盒（Whole skin dissociation kit）和配套的组织消化仪（gentleMACS Dissociator）[4-5]，另一种是联合酶消化法[6，13]。由于条件限制，本研究并未购置组织消化仪，因此主要讨论联合酶消化法及其改进方案。联合酶消化法采用混合酶溶液（1.25 mg/mL Ⅰ型胶原酶、0.5 mg/mL Ⅱ型胶原酶、0.5 mg/mL Ⅳ型胶原酶和0.1 mg/mL 透明质酸酶）在37 ℃消化真皮组织1 h，可以将组织有效消化，消化后的细胞表面抗原，如成纤维细胞抗原CD90、FAP、CD36 等保存良好，能够进行后续的流式细胞检测和原代细胞培养[6]。但是，该方案在消化瘢痕疙瘩时显得效率不足，预实验结果显示，经过1 h 的消化，细胞悬液中仍有大量聚集的细胞团，提示消化不完全。为了获得更好的消化效果，必须对联合酶消化法进行改进。

细胞成团现象产生的原因主要有两种：对细胞间连接的消化不完全，以及细胞破裂释放的游离DNA链诱导的细胞聚集[15]。为此，本研究设计了改进方案：首先，将静置消化改为摇床震荡消化（100 r/min）；其次，通过添加DNaseⅠ剪切磷酸二酯键，水解消化过程中释放的DNA 链，防止细胞聚集。Broggi 等[16]在混合胶原酶（LiberaseTM）中加入50 U/mL DNaseⅠ，结果显示该方法能够将小鼠皮肤组织消化到单细胞水平，并完成皮肤中免疫细胞的流式分析，说明该方案能够保持细胞表面抗原的完整性。本研究结果提示，单纯通过震荡消化，4 h 后仍无法获得理想的消化效果。但通过添加DNaseⅠ，细胞成团现象明显降低，单细胞比例明显升高。这表明消化液中游离的DNA 链会严重影响组织消化效率，通过去除DNA链能有效提高消化效率，获得更好的单细胞悬液制备效果。

消化时间是组织消化重要的考虑因素，适当延长消化时间有助于增加单细胞比例和单细胞数，但过度消化则会导致细胞碎片增多、细胞活性下降[15]。通常，消化时间超过5 h 对细胞活性影响较大，但需要针对不同的消化方案进行调整[15]。为此，本研究设置了时间梯度，以探究改良联合酶消化法在不同消化时长下的消化效果。结果提示，组织消化6 h 能够获得理想的单细胞比例和单细胞数，并且细胞活性与消化4 h 相比没有明显差异，而继续延长消化时间则会导致细胞成活率明显下降。因此，采用改良联合酶消化法的消化时间不宜超过6 h。

本研究通过改良联合酶消化法，提出了一种制备瘢痕疙瘩组织单细胞悬液的有效方法，为从单细胞水平研究瘢痕疙瘩中的细胞类型和疾病发生机制提供了条件。但本研究亦存在一定的局限性。首先，组织单细胞悬液的制备方法有多种，本研究集中讨论了联合酶消化法及其改良方案，并未对其他消化方法进行详尽比较，可能存在消化效果更好的方案。其次，本研究仅检测了消化后的细胞活性，并未对细胞表面抗原的保存情况进行鉴定。理论上，本消化方案并未添加胰酶等对细胞膜破坏较大的消化酶，细胞表面抗原应该得到较好保存，但在实际应用过程中，应当检测目的抗原的保存情况。

4 结论

本研究在传统联合酶消化法的基础上添加DNaseⅠ，显著提高了组织消化效率，获得了较好的瘢痕疙瘩消化效果。同时，本研究证明采用改良联合酶消化法消化6 h，能够在保持细胞活性（＞80%）的同时，获得较好的单细胞悬液制备效果。