无花果酶解制汁工艺优化及抗氧化活性

马艳弘，田丽敏，孙小华，崔晋，金秋琼，杨国慧

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京210014；2.苏州西山国家现代农业示范园区有限责任公司，江苏苏州215111；3.东北农业大学园艺园林学院，黑龙江哈尔滨150030）

无花果（Ficus carica L.），别名天仙果、明目果、映日果、奶浆果，为桑科无花果属多年生木本植物，是一种药食兼优植物，具有很高的药用营养价值[1]。无花果汁香气浓郁、酸甜适口，既含有丰富的多糖、维生素、矿质元素等，还含有多酚、黄酮等生物活性物质，其果酒、饮料等相关产品在国内外市场及其畅销。

多酚是无花果汁中重要的活性成分[2-3]，具有抗氧化和清除自由基功能，在抗癌、抗衰老、预防心脑血管疾病等方面具有很好的疗效[4-6]。据报道，果汁中植物多酚含量和种类与其抗氧化能力密切相关。果汁制备的方法包括水浴法、压榨法、离心法、酶法法、超声波辅助法等[7-8]，其中酶解榨汁技术因其具有出汁率高、对果品中功能因子的提取效率高、果汁的生物活性高等优点得到了广泛运用。因此本研究采用酶解技术制备无花果汁，并通过响应面试验优化无花果汁的最佳酶解制汁工艺并考察其体外抗氧化活性，为无花果汁的产业化生产奠定了理论基础与试验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

布莱瑞克无花果：苏州西山国家农业示范有限责任公司。

纤维素酶（活力≥10 000 U/mg）、果胶酶（活力≥30 000 U/g）：合肥Biosharp生物科技有限公司；福林酚：上海源叶生物科技有限公司；DPPH：南京藤春生物科技发展有限公司；VC：西陇科学股份有限公司；羟自由基测试盒、总抗氧化能力试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

电子天平（PL303型）：梅特勒-托利多（上海）有限公司；打浆机（MJ-BL15U11型）：广东美的生活电器制造有限公司；电热恒温水浴锅（DK-8D型）：上海精宏实验设备有限公司；紫外可见分光光度计（D-8型）：上海奥析科学仪器有限公司；漩涡混合仪（XW-80A型）：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 无花果酶解制汁工艺

称取适量无腐烂、无破损的同一成熟程度的无花果洗净，打浆成无花果浆，分别添加一定量的纤维素酶或果胶酶酶解一定时间，酶解结束后于90℃下灭酶5 min，4 000 r/min离心30 min取上清液，沉淀再重复处理1次，合并2次上清液备用，按照下列公式（1）计算出汁率。

1.3.2 无花果汁中多酚含量测定[9]

1.3.2.1 标准曲线的制作

配制浓度为1.0 mg/mL的没食子酸标准母液；再稀释为不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL）的对照品标准溶液。分别吸取1 mL不同浓度的对照品标准溶液，各加入5 mL蒸馏水和1 mL福林酚在避光下充分摇匀反应，再加入4 mL的5%碳酸钠溶液，避光下混匀漩涡，45℃避光水浴1.5 h，冷却，测定波长760 nm处的吸光值，绘制标准曲线，得到回归方程为y=0.010 9x+0.002 1（R2=0.999 6）。

1.3.2.2 无花果汁中多酚含量的测定

精密吸取1 mL的无花果汁10倍稀释液，分别加入5 mL蒸馏水和1 mL福林酚在避光下充分摇匀反应，再加入4 mL的5%碳酸钠溶液，避光下混匀漩涡，45℃避光水浴1.5 h，冷却，测定波长760 nm处的吸光值。以吸光值为Y值，根据标准曲线计算无花果汁中多酚含量。

1.3.3 单因素试验设计

分别考察不同纤维素酶添加量分别为（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%），不同果胶酶添加量分别为（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%），不同酶解温度（35、40、45、50、55、60、65 ℃），不同酶解时间（30、60、90、120、150、180 min）对无花果出汁率及汁多酚含量的影响，根据结果确定适宜的制汁条件。

1.3.4 响应面优化试验设计

根据单因素试验结果，以纤维素酶添加量、果胶酶添加量、酶解温度、酶解时间为试验因素，以出汁率与多酚含量为响应值，采取BOX-Benhnken中心组合设计进行四因素三水平试验设计[10]，通过Design-Expert 8.06软件优化酶解制汁工艺参数。各因素的水平表见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素和水平编码表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.3.5 无花果汁体外抗氧化活性测定[11-12]

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的测定

配置0.05 mg/mL的DPPH自由基溶液，根据无花果中的多酚含量稀释果汁，使其果汁中多酚含量分别0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，取不同体积的多酚溶液以及同浓度的VC溶液，加去氧水补足1 mL，分别加入5 mL DPPH溶液，混合均匀后避光反应30 min，用分光光度计分别测定517 nm处的吸光值A1，5 mL DPPH溶液与1 mL无水乙醇混合后测得的吸光度A0，5 mL无水乙醇与1 mL多酚溶液混合后测得的吸光度A2。按照公式（2）计算不同多酚浓度下无花果汁的DPPH自由基清除率。

式（2）中：A1为样品组吸光度；A2为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.3.5.2 羟自由基清除率的测定

根据无花果中的多酚含量稀释果汁，使其果汁中多酚含量分别 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，按照试剂盒说明书操作，分别取500 μL含不同质量浓度多酚的无花果汁和VC溶液，测定550 nm处的吸光值。按照式（3）计算羟自由基清除率。

1.3.5.3 总抗氧化能力测定

根据无花果中的多酚含量稀释果汁，使其果汁中多酚含量分别 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，按照试剂盒说明书操作，以同浓度的VC溶液为对照，测定不同多酚浓度下无花果汁的总抗氧化能力。

1.4 数据分析

各试验均做3次平行处理，结果取平均值。数据采用Excel软件进行误差分析，Design-Expert 8.06软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 纤维素酶添加量对无花果出汁率及汁中多酚含量的影响

纤维素酶添加量对无花果出汁率及汁中多酚含量的影响见图1。

图1 纤维素酶添加量对无花果出汁率及汁多酚含量的影响Fig.1 Effect of cellulase amount on fig juice yield and polyphenol content in the juice

如图1所示，纤维素酶添加量低于2.5%时，出汁率和多酚含量随着纤维素酶添加量的增加而升高，在纤维素酶添加量为2.5%时，出汁率和多酚含量最高，分别达到74.33%和598.13 μg/mL；当纤维素酶添加量超过2.5%时，出汁率和多酚含量随着纤维素酶添加量的增加而缓慢下降。这是由于随着纤维素酶浓度的提高，酶解效率提高，导致出汁率和汁中多酚含量升高；当纤维素酶量达到最佳值时，则酶解反应彻底，出汁率和多酚释放量最高；当纤维素酶的浓度超过最佳值，酶量过剩导致溶液体系粘度提高，反而限制了酶解反应速率[13-15]，导致了出汁率和多酚溶出量的降低。因此，确定纤维素酶的适宜添加量为2.5%。

2.1.2 果胶酶添加量对无花果出汁率及汁中多酚含量的影响

果胶酶添加量对无花果出汁率及汁中多酚含量的影响见图2。

图2 果胶酶添加量对无花果出汁率及汁多酚含量的影响Fig.2 Effect of pectinase amount on fig juice yield and polyphenol content in the juice

如图2所示，当果胶酶添加量低于0.6%时，出汁率和多酚含量随着果胶酶添加量的增加而升高，且在果胶酶添加量为0.6%时，出汁率和多酚含量最高，分别达到71.44%和604.19 μg/mL，当果胶酶添加量超过0.6%时，出汁率和多酚含量随着果胶酶添加量的增加而缓慢下降。因此，确定的果胶酶添加量以0.6%为宜。

2.1.3 酶解温度对无花果出汁率及汁中多酚含量的影响

酶解温度对无花果出汁率及汁中多酚含量的影响见图3。

图3 酶解温度对无花果出汁率及汁多酚含量的影响Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on fig juice yield and polyphenol content in the juice

如图3所示，当酶解温度在35℃～50℃时，出汁率和多酚含量随着温度的升高而升高，且在50℃时，出汁率和多酚含量最高，分别达到73.88%和605.16 μg/mL；当温度超过50℃时，出汁率和多酚含量随着温度的升高而下降。这是由于生物酶的活性具有最适合的温度，当温度超过最适温度时，酶活性降低，会直接抑制酶解反应速度，从而导致出汁率和多酚含量降低。因此，确定50℃为最佳酶解温度。

2.1.4 酶解时间对无花果出汁率及汁中多酚含量的影响

酶解时间对无花果出汁率及汁中多酚含量的影响见图4。

图4 酶解时间对无花果出汁率及汁多酚含量的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on fig juice yield and polyphenol content in the juice

如图4所示，酶解时间小于90 min时，出汁率和多酚含量随着时间的延长而升高，且在90 min时，出汁率和多酚含量最高，分别达到73.12%和622.90 μg/mL；当时间超过90 min时，出汁率和多酚含量随着时间的延长而下降。这是因为随着时间延长，酶活力可以得到充分发挥，酶解反应较完全，出汁率和多酚释放量不断升高，在最适宜的时间达到最高值；但是酶解时间越长，水份蒸发及多酚氧化程度加大，会导致出汁率和多酚释放量的降低。因此，确定90 min为适宜的酶解时间。

2.2 响应面优化结果与分析

2.2.1 回归模型建立与显著性检验

利用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-benhnken中心组合设计响应面试验，以纤维素酶添加量、果胶酶添加量、酶解温度、酶解时间4个因素为响应因子，出汁率和多酚含量为响应值，进行三因素四水平的响应面试验设计，结果如表2所示。

表2 响应面试验结果Table 2 Results of response surface tests

续表2 响应面试验结果Continue table 2 Results of response surface tests

利用Design-Expert 8.0.6软件对表2中的响应面试验数据进行多项回归拟合分析，建立二次多项回归方程如下：

从方差分析表3和表4可以看出，2个模型方程极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著，说明该模型所建立的回归方程拟合度较好，试验选取的各因素与无花果出汁率与多酚含量之间的相关性很好[16]。其中A、B、C、AC、AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2对无花果出汁率的影响极显著，BD对无花果出汁率的影响显著。4个因素影响无花果出汁率的主次因素为：酶解温度＞纤维素酶添加量＞果胶酶添加量＞酶解时间。AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2对无花果汁多酚含量的影响极显著，B、C、D、AB对无花果汁多酚含量的影响显著。由一次项的P值可知，影响无花果汁多酚含量的主次因素为：酶解温度＞酶解时间＞果胶酶添加量＞纤维素酶添加量。

表3 出汁率回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of juice yield regression model

表4 多酚含量回归模型方差分析Table 4 ANOVA of response surface model

2.2.2 响应面分析与优化

响应面分析图是指在其他因素水平稳定的条件下，响应值与试验中2个因素所构成的三维曲线面图，可以直观反映各因素之间的相互作用对响应值的影响大小。响应面曲面坡度较陡峭，表明因素变化对响应值的影响显著。以出汁率和多酚含量作为共同评价指标，最佳交互项影响具体结果见图5～图7。

由图5～图7可以看出，纤维素酶添加量与酶解时间（AD），果胶酶添加量与酶解温度（BC），酶解温度与酶解时间（CD）坡面陡峭，对无花果出汁率及其多酚含量的交互影响作用均极显著。

图5 纤维素酶添加量与酶解时间对无花果出汁率及汁多酚含量影响的响应面Fig.5 Response surface plots for the effects of cellulase amount and enzymolysis time on fig juice yield and polyphenol content in the juice

图6 果胶酶添加量与酶解温度对无花果出汁率及汁多酚含量影响的响应面Fig.6 Response surface plot for the effects of pectinase amount and enzymolysis temperature on fig juice yield and polyphenol content in the juice

图7 酶解温度与酶解时间对无花果出汁率及汁多酚含量影响的响应面Fig.7 Response surface plot for the effects of enzymolysis temperature and enzymolysis time on fig juice yield and polyphenol content in the juice

以出汁率为指标，通过软件分析，得出最优酶解工艺参数为：纤维素酶添加量2.49%、果胶酶添加量0.57%、酶解温度47.68℃、酶解时间92.60 min，预测理论无花果出汁率为77.763 5%；以多酚含量为指标，得出最优酶解工艺参数为：纤维素酶添加量2.47%、果胶酶添加量0.62%、酶解温度50.85℃、酶解时间89.28 min，预测理论多酚含量为622.136 μg/mL。为操作方便，将上述工艺参数修正为纤维素酶添加量2.5%、果胶酶添加量0.6%、酶解温度50℃、酶解时间90 min，测得实际出汁率为75.13%，实际多酚含量为626.79 μg/mL，与预测值十分接近。该模型可靠，可以用来预测产业化生产中无花果汁的出汁率及其多酚含量。

2.3 无花果汁体外抗氧化性试验结果与分析

2.3.1 不同多酚含量无花果汁的DPPH自由基清除率无花果汁多酚对DPPH·清除率见图8。

图8 无花果汁多酚对DPPH·清除率Fig.8 Scavenging rate of polyphenols in fig juice on DPPH·

由图8得知，无花果汁中多酚浓度在0.1 mg/mL～0.5 mg/mL之间，果汁对DPPH自由基的清除率随着多酚浓度的增加而提高；当多酚浓度达0.6 mg/mL，果汁对DPPH自由基的清除率最高（90.26%）。表明无花果果汁具有较强的DPPH自由基清除能力，但其自由基清除率略低于同浓度下VC的自由基清除率。

2.3.2 不同多酚含量无花果汁的羟自由基清除率

无花果汁多酚抑制羟自由基活力见图9。

图9 无花果汁多酚抑制羟自由基活力Fig.9 Inhibition of hydroxyl radical activity by polyphenols in fig juice

由图9得知，无花果汁中多酚浓度在0.1 mg/mL～0.4 mg/mL之间，果汁对羟自由基的抑制率随着多酚浓度的增加而提高，当无花果汁多酚浓度为0.6 mg/mL时，果汁的抗羟自由基活力高达250.96 U/mL；之后逐渐趋于平缓。表明一定浓度的无花果汁具有羟自由基抑制活力。但略低于同浓度下VC的羟自由基清除活力。

2.3.3 不同多酚含量无花果汁的总抗氧化能力

无花果汁多酚总抗氧化能力见图10。

图10 无花果汁多酚总抗氧化能力Fig.10 Total antioxidant capacity of polyphenols in fig juice

由图10得知，在所设多酚浓度范围内，无花果汁的总抗氧化能力随着浓度的增加而增强；当浓度在0.5 mg/mL～0.6 mg/mL之间，总抗氧化能力趋于稳定。多酚浓度为0.6 mg/mL无花果汁的总抗氧化能力最高，为84.35单位/mL。各多酚含量无花果汁的总抗氧化能力均低于同一浓度下VC溶液的抗氧化能力。

3 结论

本研究以无花果为原料，采用生物酶解法制备无花果汁，并通过单因素试验与响应面分析法优化了最优酶解制汁工艺，建立了可靠的数学模型，得到了无花果汁的最佳酶解制汁工艺参数为：纤维素酶添加量2.5%、果胶酶添加量0.6%、酶解温度50℃、酶解时间90 min，在此条件下无花果的出汁率为75.13%，汁中多酚含量高达626.79 μg/mL。通过果汁的DPPH自由基清除能力、抗羟自由基活力、及其总抗氧化能力的检测发现，酶解制备的无花果果汁具有较强的抗氧化活性，0.6 mg/mL多酚浓度的果汁，其DPPH自由基清除率、抗羟自由基活性、总抗氧化活力分别达90.26%、250.96 U/mL、84.35单位/mL。