有机物对连续流Anammox脱氮及微生物群落影响

陈重军,汪瑶琪,姜 滢,郭萌蕾,谢嘉玮,谢军祥,沈耀良,2,3

有机物对连续流Anammox脱氮及微生物群落影响

陈重军1,2,3,4,汪瑶琪1,姜 滢1,郭萌蕾1,谢嘉玮1,谢军祥1,沈耀良1,2,3

(1.苏州科技大学环境科学与工程学院,江苏 苏州 215009；2.江苏省环境科学与工程重点实验室,江苏 苏州 215009；3.江苏水处理技术与材料协同创新中心,江苏 苏州 215009；4.江苏省厌氧生物技术重点实验室,江苏 无锡 214122)

采用UASB连续流反应器,研究了不同有机物浓度对厌氧氨氧化的脱氮性能及微生物群落结构的长期影响,结果表明,在COD浓度分别为0,20,40,60和80mg/L时,40mg/L COD浓度条件下对厌氧氨氧化反应的促进程度最大,TN和COD去除率稳定在88.5%和75.3%.在低浓度COD(20mg/L)条件下,厌氧氨氧化反应受影响程度不明显,而COD为60和80mg/L时,系统脱氮性能受到不同程度的抑制.通过高通量测序技术对不同COD浓度下的微生物群落结构进行分析,结果表明不同COD浓度下,绿曲挠菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)等占据主导,且随着COD浓度从0增至80mg/L,浮霉菌门相对丰度从24.60%降至7.70%,其中的属降幅最大,丰度从12.14%减至3.63%,变形菌门相对丰度从15.40%增至36.30%,其中菌属的增幅最大,丰度从0.01%增至8.39%.

厌氧氨氧化；有机物浓度；脱氮性能；微生物群落结构；高通量测序

厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, Anammox) 反应是指在厌氧或者缺氧条件下,厌氧氨氧化菌以NO2--N为电子受体,氧化NH4+-N为氮气的生物过程[1-3].相比传统硝化-反硝化工艺,该过程可降低50%的曝气量、100%的有机碳源以及90%的运行费用[4],且污泥产率低.以厌氧氨氧化为主体的污水处理工艺研究和开发,给我国目前污水处理面临的低碳氮比废水脱氮难、能耗高、污泥产量大等问题带来了曙光.然而,实际废水中存在有机物,较高浓度的有机物存在会对厌氧氨氧化反应造成不利影响,甚至受到抑制.研究表明,当COD/N超过1.7或COD浓度超过100mg/L,将会严重抑制厌氧氨氧化反应器的性能,且随着COD浓度的增加,anammox菌的比例会下降[5-6].有机物与厌氧氨氧化系统接触时间的长短会对厌氧氨氧化反应产生不同的作用[7],特别是在长期有机物胁迫下,会对反应器效能及微生物群落结构造成重要影响[8].然而,关于在连续流反应器内有机物长期作用下的脱氮规律变化、厌氧氨氧化恢复情况及污泥微生物群落动态变化的研究报道尚少.

本文以乙酸钠作为有机物,采用UASB连续流反应器,通过调控不同浓度的乙酸钠控制进水中COD浓度,通过长期有机物胁迫研究,探究有机物在连续流反应器内对厌氧氨氧化效能影响和恢复情况,并初步明确其微生物群落结构的变化规律,旨在为厌氧氨氧化的实际应用提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 实验装置和条件

实验装置采用UASB反应器,由有机玻璃制成,反应区的内径8cm,沉淀区内径10cm,高127.40cm,持水高度119.90cm,有效容积为19.70L.反应器依靠外层的水浴夹套保持温度在(32±1)℃,整体用黑色遮阳塑料膜盖住避光,并通过蠕动泵控制进水,反应器构造见图1.

图1 UASB反应器示意

1. 集气管;2. 三相分离器;3. 出水口;4. 水浴加热出水口;5. 取样口;6. 进水口;7. 蠕动泵;8. 进水管;9. 水浴加热进水管;10. 水浴加热进水口

1.2 实验用水和运行条件

实验用水采用人工配水,UASB反应器运行维持进水NH4+-N和NO2--N浓度分别为114,150mg/L. 每个阶段提升进水COD浓度分别为20, 40, 60和80mg/L,水质稳定后回降COD为0mg/L进行恢复,具体运行状况见表1.进水pH值控制在7.5±0.5,添加KH2PO40.03g/L,MgSO40.30g/L,CaC120.18g/L, KHCO30.50g/L,1L配水添加1mL微量元素I,II,微量元素I,II配比见文献[9],整个运行周期为157d.

表1 UASB反应器运行工况

1.3 测试项目与方法

每隔2d采集反应器进出水,测定NH4+-N、NO2--N、NO3--N、COD浓度,NH4+-N:纳氏试剂分光光度法;NO2--N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法; NO3--N:紫外分光光度法;COD采用重铬酸钾法[10].

微生物测试样品共计5个,分别取自研究开始前和COD浓度分别为20,40,60,80mg/L时稳定运行的反应器内混合污泥,5个样品编号为C0、C20、C40、C60和C80.采用Illumina Misep测序平台对5个样品中的微生物进行测序分析,包括DNA提取、PCR扩增、Miseq文库构建和Miseq测序[11],微生物测序过程委托上海美吉生物医药科技有限公司完成.

2 结果与讨论

2.1 有机物对厌氧氨氧化反应器水质的长期影响分析

4个阶段反应器氮素和COD的浓度变化情况见图2~4.第一阶段,向稳定运行300多天的厌氧氨氧化反应器内添加20mg/LCOD后,初始几天NO2--N和NH4+-N的去除情况稍有波动,随后稳定, NO3--N累积量均值由21.88mg/L减少至8.75mg/L.但与未添加COD的运行状况相比,总氮去除率未出现明显变化,保持在85%左右,即20mg/LCOD的加入对厌氧氨氧化系统并无显著影响.该阶段中COD的平均去除率为42.8%.待反应器内氮素变化稳定后,停止添加有机物以恢复厌氧氨氧化脱氮系统.恢复期间反应器内脱氮菌种经历了适应期和稳定期,出水氮素在停止投加COD的前4d变化较大,之后逐步稳定.

图2 不同有机物浓度下氮素的变化情况

图3 不同有机物浓度下COD的变化情况

第二阶段,向进水中投加40mg/L的COD,该阶段氮素平均去除率为88%,高于第一阶段的85%,出水中NO2--N和NH4+-N剩余量均值为4.21mg/L和1.80mg/L,NO3--N的累积量减至7.48mg/L.与氮素去除率提高一致,COD去除率升高至75.3%,表明反应系统厌氧氨氧化菌和其他脱氮功能菌共存,共同协作提升氮素和碳素的去除率[12].随后停止添加有机物,反应器进入第二阶段的恢复期.

第三阶段,继续增大进水COD浓度至60mg/L,出水NO2--N和NH4+-N浓度逐渐升高,稳定后平均去除率降至84.4%和80.3%,TN去除率降至73.2%, COD去除率也相应降至60.0%,表明COD为60mg/L时已经对厌氧氨氧化反应产生抑制作用.待氮素去除稳定后,停止有机物投加,初始几天氮素和碳素去除率变化不大,可能是反应器内残留一定的有机物,随后出水NO2--N和NH4+-N浓度逐渐降低.然而,由于该阶段厌氧氨氧化系统受有机物影响,反应器运行状况未回归至第一阶段前.

图4 不同有机物浓度下氨氮和亚硝酸盐氮去除率的变化情况

第四阶段,继续提高进水有机物浓度至COD为80mg/L,经过短暂的适应期后,反应器出水迅速恶化,出水NO2--N和NH4+-N浓度逐渐增加,分别由第四阶段初的7.64,18.06mg/L升至78.61,59.31mg/L,TN去除率降至50%.碳素和氮素的去除情况类似,COD的去除率下降至35.5%,表明该阶段厌氧氨氧化反应受到较为严重的抑制.为减少对反应器内的厌氧氨氧化菌的抑制,在投加80mg/LCOD后的第16d开始,停止投加有机物,进行反应器的性能恢复试验.与前三个阶段的恢复期相比,该阶段恢复期较长.

低浓度有机物的加入对厌氧氨氧化反应影响不大或无明显影响,高浓度对其有抑制或毒性作用,介于两种情况间可能存在对其促进作用最佳的有机物浓度[13-14].朱葛夫等[15]采用CSTR厌氧氨氧化反应器,发现COD浓度小于120mg/L时可促进厌氧氨氧化反应,但高于200mg/L时产生抑制效果.管勇杰等[16]考察乙酸钠对ASBR反应器内厌氧氨氧化的影响,表明厌氧氨氧化活性在COD浓度为80mg/L时达到最大值.操沈彬等[17]通过批次试验说明当NO2--N浓度为35mg/L左右时,乙酸钠浓度在200mg/L以下并不会对厌氧氨氧化系统有冲击影响,且一定程度上促进了厌氧氨氧化反应.也有研究表明,当有机碳源质量浓度大于110mg/L时,会抑制厌氧氨氧化反应[18].本研究中40mg/L的COD是UASB反应器内对厌氧氨氧化反应有促进影响效果的最佳浓度值,低于其他学者的研究结果,推测可能是反应器类型、接种污泥不同等造成的,再加上本试验UASB反应器长期培养厌氧氨氧化污泥,试验开始前污泥中厌氧氨氧化菌占总细菌比例高达31.40%,其他脱氮功能菌占比较少,造成异养菌不能消耗掉大量有机物而为厌氧氨氧化菌生存提供有利条件.

2.2 有机物对厌氧氨氧化反应器微生物群落结构的影响分析

2.2.1 各浓度下微生物丰度和多样性分析 样品C0、C20、C40、C60和C80序列数均在30087~36891间,有机物胁迫下对序列数变化影响不大(表2). Chao和ACE指数表示样品微生物群落丰富度,值越大代表物种总数越多;Shannon指数反映了基于物种数量的群落种类多样性,指数越大表明群落的复杂程度越高;Simpson指数体现了优势物种生物量占群落生物总量的比重,该指数越大表明优势菌群生物量占总生物量比重越大[19].由此,样品C40所含微生物种类较其他样品少,优势菌群占比大,也就是说添加40mg/L的COD,反应器内微生物种群复杂度降低,功能优势菌群占比突出.

表2 UASB反应器污泥细菌丰度变化情况

2.2.2 各COD浓度下微生物门分类水平的相对丰度变化 各COD浓度下污泥样品微生物在门丰度上占比较多的依次为绿曲挠菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)和放线菌门(Actinobacteria),表明加入有机物后反应器内主要菌群种类并未改变,仅在优势占比上有所变动(图5).其中,绿曲挠菌门常在厌氧氨氧化反应器中检出,具有固碳功能,能将CO2固定为丙酮酸,但在厌氧氨氧化反应器中承担何种角色还未可知[20-21].反应器中脱氮功能菌为变形菌门和浮霉菌门,而厌氧氨氧化菌主要存在于浮霉菌门中,浮霉菌门在所有细菌数目中的占比可反映出厌氧氨氧化菌的生存状态.

图5 各COD浓度下细菌在门层面上的群落组成变化情况

随着有机物浓度的增加,浮霉菌门的相对丰度总体呈现降低趋势,而变形菌门相对丰度逐渐增高(图6).当反应器进水基质中未添加有机物时,浮霉菌门相对丰度占比高达24.60%,是厌氧氨氧化反应系统内绝对优势菌群.当COD浓度增至20,40mg/L时,浮霉菌门的相对丰度减小,变形菌门相对丰度有增长趋势,但幅度变化不大,均在15%左右波动.有机物浓度持续增大,两种脱氮功能菌所占百分比差异不断增大,变形菌门成为反应器优势种群,浮霉菌门在有机物的影响下受到抑制,其中当COD=80mg/L时,浮霉菌门占比锐减至7.70%,而变形菌门增至36.30%.有机物浓度的增高,会直接影响厌氧氨氧化反应器内微生物的群落结构,且抑制浮霉菌门微生物的生长.有机物的加入打破了厌氧氨氧化菌作为优势菌的地位,有机物加入促使反硝化菌数量增加[22-23].本研究当COD浓度为20mg/L时,厌氧氨氧化反应的脱氮功能无明显影响,而厌氧氨氧化菌所在的浮霉菌门丰度已减至9.80%,可能是因为反应器内污泥含量较多,菌体基数较大,对反应基质中的氮素去除影响并不明显.而当COD浓度为40mg/L时,变形菌门和浮霉菌门相对丰度占比未有明显变化,但氮素去除率从85.1%增至88.5%,反应器内细菌种群类别减少,复杂度降低,这与表2的结果相对应.然而,当COD浓度增至60mg/L以上,变形菌门利用系统内的有机物快速增殖,消耗基质,虽然浮霉菌门相对比例有所上升,但推测一定程度上抑制了浮霉菌门的活性,造成TN去除率降低.

图6 各COD浓度下浮霉菌门和变形菌门占比变化情况

2.2.3 各COD浓度下微生物属分类水平的相对丰度变化 将主要脱氮功能菌浮霉菌门和变形菌门下的菌群进行属层面上的分析,见图7.浮霉菌门中占比较多的为、和SM1A02,均为常见的种属[24-25].属以亚硝酸为能源,以CO2为碳源,最早是在荷兰的污水处理厂污泥中发现的,是第一个被富集鉴定的ANAMMOX菌种[26].与属一致,属以CO2为唯一碳源,通过氧化 NO2--N为 NO3--N获得能量,最初是在德国斯图加特废水处理滴滤池中发现的[27].随着有机物浓度的增大,属丰度一直呈现下降趋势,所占百分比从12.14%降至3.63%,但却一直是浮霉菌门中的主导菌属,可能是因其是生物进化策略中的R型策略者,拥有更高的生长率[28].而其他三种菌属均呈现先下降后小幅度升高最后又降低的趋势. 4种菌属中SM1A02占比变化最小,表明有机物浓度对SM1A02菌属的丰度影响最小.

变形菌门中、Unclassfied、、和菌属是所有菌属中比例较大的5类菌.蛭弧菌()一般具有噬菌的特性,但在厌氧氨氧化反应器内的作用还需进一步研究.伯克氏菌属()广泛存在于自然环境中,一般在高温环境中被检测到,本文研究装置置于(32±1)℃,为该菌的生长提供了适宜条件[29].具有反硝化性能,在有机碳源存在的厌氧环境中常被检测到[30].丛毛单胞菌科()异养菌,可以降解有机物,有机物增加会提升其相对丰度[31].假单胞菌属()大部分有机化能异养菌,呼吸代谢,也有兼性化能自养菌,能利用H2或CO2作为能源.分子氧是普遍的电子受体,部分能利用硝酸盐作为电子受体进行反硝化[31].其中菌属增幅最大,其丰度从未添加有机物时的0.01%增至COD=80mg/L时的8.39%,而菌属是在反应器氮素去除效果最好的时候比例减至最低(1.89%),其他菌属变化规律尚不明显,具体原因还有待进一步研究.

图7 各COD浓度下浮霉菌门和变形菌门的群落组成(属)相对百分比

3 结论

3.1 在40mg/L COD浓度条件下对厌氧氨氧化反应的促进程度最大,TN和COD去除率稳定在88.5%和75.3%.在低浓度COD(20mg/L)条件下,厌氧氨氧化反应受影响程度不明显,而COD为60,80mg/L时,系统脱氮性能受到不同程度的抑制.

3.2 通过高通量测序技术对不同COD浓度下的微生物群落结构进行分析,结果表明不同COD浓度下,绿曲挠菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)等占据主导,且随着COD浓度从0升至80mg/L,浮霉菌门相对丰度从24.60%降至7.70%,其中的属降幅最大,丰度从12.14%减小至3.63%,变形菌门相对丰度从15.40%增至36.30%,其中菌属的增幅最大,丰度从0.01%增至8.39%.

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Effects of organic matter on nitrogen removal and microbial community in anammox reactor.

CHEN Chong-jun1,2,3,4, WANG Yao-qi1, JIANG Ying1, GUO Meng-lei1, XIE Jia-wei1, XIE Jun-xiang1, SHEN Yao-liang1,2,3

(1.School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China；2.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Environmental Science and Engineering, Suzhou 215009, China；3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Technology and Material of Water Treatment, Suzhou 215009, China；4.Jiangsu Key Laboratory of Anaerobic Biotechnology, Wuxi 214122, China)., 2019,39(12)：5049~5055

The UASB continuous flow reactor was used to study the long-term effects of different organic concentrations on the anammox nitrogen removal and microbial community structure. The results showed that the 40mg/L of COD concentration provided the most promotion to anammox reaction among the COD concentration levels with 0, 20, 40, 60 and 80mg/L. At this concentration, the TN and COD removal rates were stabilized at 88.5% and 75.3%, respectively. Under a lower level (20mg/L), the anammox reaction was not affected significantly. However, the nitrogen removal performance was inhibited when the COD concentrations were higher at 60 and 80mg/L. The microbial community structure under different COD concentrations was analyzed by high-throughput sequencing technology. The results indicated that the Chloroflexi, Planctomycetes, Proteobacteria and Actinobacteria were always dominated under different COD concentrations, their relative abundance varied in different scenarios. The relative abundance of Planctomycetes was decreased from 24.60% to 7.70% with the increase of COD concentration (0 to 80mg/L). Among them,declined fastest, and the abundance was decreased from 12.14% to 3.63%. The relative abundance of Proteobacteria was increased from 15.40% to 36.30%, among whichhad the biggest increase from 0.01% to 8.39%.

anammox；organic matter concentration；nitrogen removal；microbial community；high throughput sequencing

X703

A

1000-6923(2019)12-5049-07

陈重军(1984-),男,浙江义乌人,苏州科技大学环境科学与工程学院副教授,主要从事废水生物处理技术与机制研究.发表论文50余篇.

2019-05-16

国家自然科学基金项目(51508366,51308367);江苏省环境科学与工程重点实验室开放基金(Zd1804);江苏省厌氧生物技术重点实验室开放基金(KFLAB201701)

* 责任作者, 副教授, chongjunchen@163.com