LMP-1重组质粒滴鼻对变应性鼻炎鼠模型Th2方向的免疫调节作用

朱学伟，段伟那,2，陈明星*

(1.吉林大学中日联谊医院 耳鼻咽喉头颈外科，吉林 长春130033；2.内蒙古医科大学基础医学院)

近一个世纪以来，变应性疾病的发病率增加，医疗支出加剧，给病患及社会带来沉重负担。包括细菌超抗原，病毒以及大气污染等外界环境因素变化对变应性鼻炎的影响为我们提出新的问题与挑战。病毒广泛存在于呼吸道，中国10岁以上人口EB病毒(EBv)感染率高达86%以上，是研究呼吸道变态反应中不能忽视的外部因素[1]。近年来研究显示，病毒感染不但与肿瘤有关而且与变应性鼻炎及哮喘密切相关，可能是促进变应性鼻炎发生发展的重要病因之一[2]。本研究拟通过制备LMP-1重组质粒，并滴鼻观察其对变应性鼻炎鼠模型鼻黏膜组织Th2方向的免疫调节细胞因子IL-5以及IL-13影响。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物BALB/c小鼠常规饲养于吉林大学白求恩医学部实验动物中心，雌雄各20只，均为8-10周龄，体重在20-25 g， 12 h间断照明。 LMP-1重组质粒及脂质体订购于中国公共蛋白及质粒实验室(Public Protein/Plasmid Library,China;PPL)。LMP-1插入片段大小为1 161 bp，Gene ID:378750。氢氧化铝胶、卵清蛋白(ovalbumin，OVA) 均为美国Sigma公司产品。鼠IL-5抗体以及IL-13购置于加拿大Biowen公司。免疫组织化学染色试剂盒为加拿大Boisynthesis Blotechnology公司产品。

1.2 分组40只BALB/c鼠分为2组，每组 20只，分别为：AR模型组、质粒组。 两组动物模型均经过3个阶段，即第1阶段腹腔注射基础致敏，第2 阶段滴鼻激发。第1阶段腹腔注射，分别以20 μg OVA加铝佐剂在于第0、7、14天进行。腹腔注射后，进行滴鼻激发，5% OVA滴鼻，每侧10 μl，连续5天。第3阶段AR模型组连续两天给予20 μl空白脂质体滴鼻，质粒组连续两天给予20 μl脂质体包裹的质粒(质粒和脂质体比例1∶2.5，浓度为0.25/μl)。给药后进行症状观察：第2次鼻内给予脂质体滴鼻后，观察计数每个小鼠1 h内抓鼻及喷嚏次数，并用摄像机进行摄录。

1.3 免疫组织化学方法

第2次鼻内给药后1天，处死小鼠，获取新鲜鼻甲，鼻中隔黏膜组织。鼻黏膜组织经10%的甲醛固定、脱钙、包埋、切片，进行苏木素一伊红染色，观察嗜酸性粒细胞浸润情况。计数方法采用3个随机200倍视野下的平均数进行计数。

获得的鼻黏膜组织切片经10%的山羊血清封闭后，进行免疫组织化学染色分析。IL-5以及IL-13的免疫组织化学操作参照免疫组化试剂盒进行。结果分析采用图像分析系统进行，结果计算5个200倍视野下的阳性细胞光密度值。以均数±标准差表示。染色细胞比例超过25%计为表达阳性。光密度值×阳性面积值/100=表达指数。

1.4 统计学方法

实验所得数据采用均数±标准差表示。数据均进行正态性检验，统计学分析采用SPSS16.0软件进行。两组间数据比较采用t检验。P≤0.05被视为有统计学意义。

2 结果

两组40个小鼠经OVA滴鼻后均产生喷鼻及抓鼻的过敏性鼻炎的症状。HE染色结果显示，LMP-1重组质粒组小鼠鼻黏膜组织产生大量的嗜酸性粒细胞聚集，与AR模型组对照比较结果具有统计学意义(P≤0.05)。免疫组化结果证实LMP-1重组质粒鼻内刺激变应性鼻炎鼠模型鼻黏膜上皮细胞中IL-5以及IL-13高表达，表达指数与AR模型组对照比较结果具有统计学意义(P≤0.05)。见表1。

表1 两组动物模型嗜酸性粒细胞计数及IL-5以及IL-13表达指数结果比较

3 讨论

病毒感染对呼吸道过敏性疾病的影响有两个方面:“保护作用”和“增强作用”。两个方面并不冲突而是在变应 性鼻炎不同阶段的不同作用。“保护作用”指许多研究表明个体早期病毒感染可以减少过敏发展的机会，这一观点被卫生假说 (“hygiene hypothesis”)所支持。其“增强作用”指包括鼻病 毒(rhinovirus)及EB病毒感染会放大气道过敏的临床症状。Contoli M等[3]发现变应性性鼻炎患者在鼻病毒RV-16病毒株的感染后,复制数量与鼻黏膜上皮细胞IL-4 mRNA水平增加具有相关性。鼻病毒通过对鼻黏膜上皮细胞TLR3表达的抑制及细胞信号IRF通路抑制，限制了机体对RV-16防御免疫反应的强度,增加鼻变态反应Th2方向的主要细胞 因子IL-4和IL-13水平。英国的Cakebread JA等[4]发现鼻病毒感染诱 导的炎症可导致支气管上皮细胞Th2炎性细胞因子IP-10， IL-8和 GM-CSF的释放，进而放大变态反应强度。

可见，病毒感染对呼吸道病毒感染Th2方向的细胞因子及变态反应有明确的促进及增强作用。EB病毒及其特征蛋白 LMP-1促进细胞 HMGB1表达，而 HMGB1 促进嗜酸性粒细胞存活，是调控鼻变态反应的关键信号之前的研究显示，EB病毒主要病毒基因LMP-1 DNA水平与鼻黏膜上皮细胞的促进变态反应的水平具有相关性。Th2方向的变态反应强度与鼻黏膜上皮细胞TSLP的表达水平也具有相关性[5]。鼻黏膜上皮细胞是启动鼻变态反应的关键靶细胞，之前相关研究也证实，小核酸CpG通过滴鼻也会促进动物模型鼻变态反应的强度[6]。总之，本研究证实鼻黏膜上皮细胞EB病毒重要基因LMP-1感染可能参与鼻变态反应的诱导、增强作用，其机制可能是EB病毒LMP-1通过刺激释放鼻黏膜上皮细胞表达的Th2方向的免疫细胞因子IL-5以及IL-13进行调节。