高温对韭菜根际微生物多样性的影响

周仙红　王琰　范晓杰　高欢欢　覃冬云　庄乾营　于毅

摘要：为明确高温对韭菜根际微生物多样性的影响，本研究通过对高温处理的韭菜根部及根际土壤中的微生物进行分离纯化，并对分离得到的真菌和细菌分别采用ITS和16S rDNA基因分析方法进行鉴定。结果表明，未分离出真菌，分离鉴定出20种细菌。其中，在无韭蛆组的韭菜根部和根际土壤中分别分离出14、12种细菌，有韭蛆组的韭菜根部和土壤中分别分离出14、13种细菌，以变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）细菌为主，其余的细菌属于放线菌门（Actinobacteria）。温度越高，厚壁菌门及放线菌门细菌出现频率越高;高温处理（35～50℃）的韭菜根部和根际土壤中细菌种类均少于其对照组。

关键词：韭蛆;韭菜;高温;根际微生物;多样性

中图分类号：S477+.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）11-0081-06

Effects of High Temperature on Rhizosphere

Microbial Diversity of Chives

Zhou Xianhong1， Wang Yan2， Fan Xiaojie1， Gao Huanhuan3， Qin Dongyun1， Zhuang Qianying1， Yu Yi1

（1. Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Key Laboratory for Plant Virology of Shandong Province， Jinan 250100， China;

2. Agricultural Comprehensive Law Enforcement Unit of Rushan City， Rushan 264500， China;

3. Shandong Institute of Grape， Jinan 250100， China）

Abstract To understand the effect of high temperature on the diversity of rhizosphere microorganisms of chives， the microorganisms from the roots （partial bulbs and nearby roots） and soils under high temperature treatment were separated， purified and identified through ITS and 16S rDNA genetic analysis. The results showed that no fungi were isolated and 20 kinds of bacteria were identified. Fourteen and twelve bacterial species were identified from the chive roots and soils in no Bradysia odoriphaga group respectively，and 14 and 13 bacterial species were identified from the chive roots and soils in group with B. odoriphaga， respectively. Most bacterial species belonged to the Proteobacteria and Firmicutes， the rest belonged to Actinobacteria. The bacteria of Firmicutes and Actinobacteria were discovered at higher temperatures. The bacterial species from the chive roots and soils at high temperatures （35～50℃） were less than those of the control group.

Keywords Bradysia odoriphaga; Chives; High temperature; Rhizosphere microorganism; Diversity

韭菜迟眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga Yang et Zhang）属双翅目长角亚目眼蕈蚊科迟眼蕈蚊属，是韭菜、葱、蒜等蔬菜的重要害虫，俗称韭蛆[1， 2]。韭蛆幼虫群集蛀食韭菜根部、假茎和鳞茎使其腐烂，腐烂部位会出现大量微生物，韭蛆在微生物富集的環境中可以大量生存繁殖，这说明在韭蛆、韭菜以及微生物之间存在密不可分的关系[3]。

植物根际微生物主要分为抑制植物生长的有害微生物和促进植物生长的有益微生物[4]，其多样性受自然因素、人为因素等多种因素的影响。其中自然因素包括土壤质地、土壤温度、土壤水分含量、土壤pH值、有机质和矿物质含量等;人为因素主要为农业耕作方式、种植制度、农业植被类型、田间管理等。由于人类农业活动对土壤的物理化学性质产生影响从而影响土壤中微生物的多样性[5-7]。微生物与宿主植物及昆虫之间存在的也不仅仅是致病关系，还包括互利的非致病关系。微生物可以通过产生激素类物质、促进植物养分吸收、诱导植株增强抗性等直接作用方式、抑制病原菌生长的间接作用方式促进植物生长[8]。有些微生物是昆虫生长发育、繁殖所必需的。昆虫的取食作用可对土壤微生物群落结构产生显著影响，如细菌真菌比、细菌群落中革兰氏阳性菌和阴性菌的相对比例以及菌根真菌的群落结构等[9]。有研究表明蚜虫低强度的取食作用可以诱导水稻根系土壤微生物的生物量[10]，两种飞蛾幼虫（Operophtera brumata， Epirrita autumnata）对树木叶片的爆发性取食会导致土壤微生物群落中的细菌数量显著上升[11]。

地表覆膜法防治韭蛆效果很好，其技术要求土壤温度达到39℃以上，此时对韭菜生长无影响[12，13]，但对韭菜根部和根际土壤微生物多样性是否有影响尚不清楚。本研究通过室内试验，利用ITS和16S rDNA基因分析方法研究高温对韭菜根际微生物多样性的影响，为更好地应用高温覆膜防治韭蛆提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试韭菜：三年生独根红，采自山东省农业科学院植物保护研究所，割去地上部后挖根带土单株移栽至花盆（Φ=10 cm）中。

供试昆虫：韭菜迟眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga Yang et Zhang）采自山东省寿光市韭菜田，于山东省农业科学院植物保护研究所养虫室内用人工饲料[14]连续饲养多代，饲养条件为温度（25±1）℃、相对湿度（70±5）%。选用健康的3龄幼虫为试验用虫。

1.2 试验仪器与试剂

超净工作台（SW-Cj-ZFD，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司），电热鼓风干燥箱（101-1ES，北京市永光明医疗仪器厂），人工气候培养箱（RXZ-328A型，宁波江南仪器厂），离心机（D-78532，德国Tuttlingen），PCR仪（EPS301，美国Pharmacia），电泳仪（JY3000，北京君意东方电泳设备有限公司），凝胶成像系统（JY04S-3C，北京君意东方电泳设备有限公司）。NB培养基，孟加拉红培养基，PBS 缓冲液，DNA 提取试剂盒DV811A（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，天根生化科技有限公司），2×Taq PlusPCR Master Mix（天根生化科技有限公司），土豆，葡萄糖，琼脂粉，一次性培养皿，16S rDNA和ITS引物。

1.3 试验前期处理

试验分为5组：35℃、40℃、45℃、50℃及CK处理（室温），每种温度条件下分别设置有韭蛆处理组（每盆接入20头3龄幼虫）和无韭蛆处理组。将有韭蛆和无韭蛆的单盆韭菜分别用60目防虫网罩罩上，20 d后在不同温度下处理4 h，每个处理重复3盆。

1.4 微生物的分离纯化及鉴定

1.4.1 微生物的分离纯化

选取韭菜根部（包括鳞茎及附近根，以下均用根部表示）和根际土壤分别用无菌 PBS 缓冲液浸泡。吸取浸泡液分别用无菌水稀释106、107、108、109倍，制备不同浓度的菌悬液。分别吸取200 μL涂布于NB板、PDA培养基和孟加拉红培养基平板上，每个浓度3个重复。涂板后放置25℃培养箱中培养48 h。在单菌落明显的NB培养基、PDA培养基和孟加拉红培养基中统计单菌落个数，根据稀释浓度计算不同处理菌悬液中细菌和真菌的数量。

选择PDA培养基和孟加拉红培养基平板中的真菌，挑取菌落在新的PDA平板中纯化3次。纯化好的真菌保存到PDA培养基斜面上，放置在 4℃保存备用。

选择细菌单菌落进行划线纯化，25℃培养箱中培养。菌落出现后，连续划线培养4～5次，挑取纯化好的菌落进行编号，在NB液体培养基中过夜摇菌，加等体积60%的甘油于-20℃保存备用。

1.4.2 微生物的鉴定

（1）细菌的鉴定：采用16S rDNA鉴定法。提取分离纯化后的细菌 DNA并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，检测合格后保存于-20℃冰箱备用。PCR反应体系为：DNA 模板1 μL，2×Taq Plus PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O补充至25 μL。PCR 反应程序为：94℃ 3 min;94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环;72℃ 5 min。退火时间因细菌不同而不同。引物序列：16S rDNA-27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;16S rDNA-1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。

（2）真菌的鉴定：采用 ITS 鉴定法。收集分离纯化后的真菌菌丝提取 DNA并进行 PCR 扩增反应，DNA 提取方法及PCR反应体系同上。PCR 反应程序：94℃ 3 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环;72℃ 5 min。引物序列：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

（3）测序分析：将PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，其中16S rDNA為双向测序，ITS为单向测序。将测序结果在NCBI网站上进行BLAST分析，以此判断微生物的分类地位。

2 结果与分析

2.1 高温处理下韭菜根际微生物的分离鉴定

从不同温度处理的韭菜根部和根际土壤中未分离出真菌，细菌20种，所得细菌隶属于变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）。其中包括变形菌门α-变形菌纲的柄杆菌属（Caulobacter sp.）和鞘脂单胞菌属（Sphingomonas sp.），β-变形菌纲的争论贪食菌（Variovorax paradoxus）和代尔夫特菌属（Delftia sp.），γ-变形菌纲的多食鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium multivorum）、无色杆菌属（Achromobacter sp.）、2种肠杆菌属（Enterobacter sp.）和3种假单胞杆菌属（Pseudomonas sp.）细菌;厚壁菌门芽孢杆菌纲的7种芽孢杆菌属（Bacillus sp.）以及放线菌门放线菌纲的2种节杆菌属（Arthrobacter sp.）细菌。

如表1所示，无韭蛆处理组共分离出18种细菌。根部分离出14种细菌，变形菌门、厚壁菌门和放线菌门比例分别为53.4%、33.3%和13.3%。CK组（室温无韭蛆组）分离出5种变形菌门、2种厚壁菌门和2种放线菌门共9种细菌;35℃分离出1种变形菌门和2种厚壁菌门共3种细菌;40℃分离出3种变形菌门和1种厚壁菌门共4种细菌;45℃分离出2种变形菌门和1种放线菌门共3种细菌;50℃分离出2种变形菌门、1种厚壁菌门和2种放线菌门共5种细菌。土壤中分离出12种细菌，以变形菌门和厚壁菌门细菌为主，变形菌门、厚壁菌门和放线菌门分别占46.2%、38.5%和15.3%。CK组分离出3种变形菌门、2种厚壁菌门和1种放线菌门共6种细菌;35℃分离出1种变形菌门和3种厚壁菌门共4种细菌;40℃分离出2种变形菌门、1种厚壁菌门和1种放线菌门共4种细菌;45℃分离出3种变形菌门、1种厚壁菌门和1种放线菌门共5种细菌;50℃分离出2种变形菌门、2种厚壁菌门和1种放线菌门共5种细菌。

表2结果表明，有韭蛆处理组共分离出16种细菌。韭菜根部分离出14种细菌，变形菌门、厚壁菌门和放线菌门分别占57.1%、28.6%和14.3%。CK组（室温有韭蛆组）分离出4种变形菌门、1种厚壁菌门和1种放线菌门共6种细菌;35℃分离出2种变形菌门和2种放线菌门共4种细菌;40℃分离出3种变形菌门和2种厚壁菌门共5种细菌;45℃分离出1种变形菌门和2种放线菌门共3种细菌;50℃分离出3种变形菌门和2种厚壁菌门共5种细菌。根际土壤中分离出13种细菌，变形菌门、厚壁菌门和放线菌门分别占53.8%、30.8%和15.4%。CK组分离出3种变形菌门、3种厚壁菌门和1种放线菌门共7种细菌;35℃分离出1种变形菌门和1种厚壁菌门共2种细菌;40℃分离出1种变形菌门、1种厚壁菌门和2种放线菌门共4种细菌;45℃分离出2种变形菌门、2种厚壁菌门和1种放线菌门共5种细菌;50℃分离出2种变形菌门、2种厚壁菌门和1种放线菌门共5种细菌。

综上所述，无韭蛆和有韭蛆高温处理（35℃～50℃）组的细菌种类均少于其对照组。变形菌门细菌为优势菌群，厚壁菌门次之，放线菌门最少。温度高时厚壁菌门及放线菌门细菌出现频率高。

2.2 基因同源性比对及系统发育分析

通过16S rDNA 序列比对发现，分离出的细菌与NCBI 核苷酸数据库中序列的同源性均达到99%以上，其中代尔夫特菌属 （Delftia sp.）、解淀粉芽孢杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens）、食物芽孢杆菌 （Bacillus cibi）、枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）、短小芽孢杆菌 （Bacillus pumilus）、滋养节杆菌 （Arthrobacter pascens）和节杆菌属 （Arthrobacter sp.）分别与 MF689014.1、DQ422953.1、KU601303.1、JF496331.1、KJ526890.1、KC934790.1和 JN601428.1的序列完全吻合，达到100%的同源性（图1）。

3 讨论与结论

本研究对韭菜根部及根际土壤微生物进行分离纯化，并对分离得到的真菌及细菌分别采用 ITS 和 16S rDNA 基因分析方法进行鉴定，总共分离鉴定出真菌0种、细菌20种。其中无韭蛆组韭菜根部和根际土壤分别分离出14、12种细菌，有韭蛆组韭菜分别分离出14、13种细菌，以变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）细菌为主，其次为放线菌门（Actinobacteria）。

本研究分离出的多种芽孢杆菌可能对有益于韭蛆生长的细菌具有抑制作用[3]。有些细菌在宿主的生理过程中起到重要作用。有研究发现解淀粉芽孢杆菌（B. Amyloliquefaciens）是一种与枯草芽孢杆菌（B. subtilis）具有很高亲缘性并且具有广泛抑菌谱的细菌，其菌体及一系列代谢产物可以抑制细菌以及真菌的生长[15， 16]。郝建安等研究表明，解淀粉芽孢杆菌NK10.BAhjaWT 菌株对茄病镰刀菌 （Fusarinm solani）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn）、黑曲霉（Aspergillus niger）等多种真菌都有较好的抑制作用[17]，同时解淀粉芽孢杆菌也是一种纤维素酶产生菌，对于取食韭菜这种纤维素含量较多的植物昆虫来说可能有助于其消化[3]。假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）多定殖于土壤、水和植物根系中，具有抑制植物病原菌、帮助植物吸收营养、促进其生长的作用[18];荧光假单胞杆菌（P. fluorescens）能有效保护植物根系免受病原微生物的侵害，在维持植物根际平衡和防治农作物疾病方面起着重要作用[19];恶臭假单胞杆菌（P. putida，Hall Judith）具有谷氨酰胺转氨酶活性，能显著促进植物根的生长[20， 21];多食鞘氨醇菌（S. multivorum）ED菌株对生活污泥具有较好的生物降解作用[22]。

试验结果表明有韭蛆组细菌数量较无韭蛆组数量少，可能是由于韭蛆取食韭菜导致。有研究证明昆虫的取食强度、持续时间等会对根际土壤微生物产生影响，如蚜虫低强度的取食作用可以诱导水稻根系生物量明显增加，从而增加土壤微生物的生物量，但高强度的取食作用会导致水稻根系生物量显著减少而抑制根际微生物的活动[10]。厚壁菌门的芽孢杆菌（Bacillus sp.）对高温有较强的耐受性，例如枯草芽孢杆菌90℃处理10 min后死亡率为12%左右[23];车敏娜等研究证明放线菌门细菌具有较强的耐热性，有些放线菌生长温度范围在50～65℃[24]，与本试验中温度高时厚壁菌门及放线菌门细菌出现频率高一致。本试验高温处理后细菌种类少于对照组，可能是试验设置的温度超过了有些细菌的生长温度，从而导致細菌种类减少。宋健等的田间调查研究也表明高温覆膜0 d土壤微生物的丰富度指数低于对照但无显著差异[13]。本试验采用传统培养方法探明了高温下根际微生物的适应能力，可为田间覆膜技术的应用提供科学有效的理论依据。

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收稿日期：2019-06-25

基金项目：山东省农业科学院农业科技创新工程项目（CXGC2018E04，CXGC2016B11）;国家重点研发计划项目（2018YFD0201207）

作者简介：周仙红（1982—），女，博士，主要研究方向为害蟲综合防治。E-mail：zhouxianhong82@163.com

通讯作者：于毅（1965—），男，研究员，主要研究方向为害虫综合防治。E-mail：robertyuyi@163.com