不饱和脂肪酸对人胃癌细胞PI3K-Akt信号通路中相关基因表达的影响

俞发荣, 李建军, YU Xin, 连秀珍, 谢明仁,*, 李登楼

不饱和脂肪酸对人胃癌细胞PI3K-Akt信号通路中相关基因表达的影响

俞发荣1, 李建军1, YU Xin2, 连秀珍1, 谢明仁1,*, 李登楼1

1. 甘肃政法大学 甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室, 甘肃 兰州 730070 2. Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, US

为了探索不饱和脂肪酸(USFA)对人胃癌细胞PI3K-Akt信号通路中相关基因表达的影响, 取2×106个·L-1胃癌细胞接种于96孔培养板, 3个浓度给药组: 分别加0.2,0.8,1.6 mg·L-1USFA每孔10 µL; 5-FU组: 每孔加10 mg·L-15-FU 10 µL; 对照组: 每孔加二甲基亚砜(30 µL·L-1)10 µL。置于37℃、5%CO2的饱和湿度条件中培养48 h。用流式细胞仪检测USFA对人胃癌细胞凋亡率; 用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测胃癌细胞中粘着斑激酶(FAK)、蛋白激酶(Akt)表达水平。结果发现, 给予人胃癌细胞0.2,0.8,1.6 mg·L-1USFA培养48 h, 细胞凋亡率分别为17.42%, 23.23%, 26.24% (<0.05,<0.01); FAK和Akt水平比对照组分别降低10.91%, 47.28%, 64.36% 和17.33%, 34.96%, 54.39%(<0.05,<0.01)。结果表明, USFA对人胃癌细胞增殖的抑制作用与抑制细胞分裂周期、下调PI3K-Akt信号通路中FAK、Akt水平有关。

不饱和脂肪酸; 人胃癌细胞; 细胞分裂周期; 凋亡; PI3K-Akt信号通路

0 前言

近年来, 随着脂肪酸研究的不断深入, 人们认识到不饱和脂肪酸是人体必需的重要的营养物质[1], 其对于维持人体健康[2]、提高肿瘤患者的免疫功能[3]、改善营养状态[4]起着重要的促进作用。其中某些不饱和脂肪酸具有明显的细胞毒性和抗肿瘤作用[5, 6]。研究表明, 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶(Akt)与肿瘤的发生、发展有主要关系。PI3K-Akt信号通路调节肿瘤细胞的分裂、生存。PI3K-Akt信号转导通路被激活时, 促进细胞增殖[7], 被抑制时, 加速细胞凋亡, 起到抑制细胞增殖效应[8]。体外实验发现, 给予人胃癌细胞不饱和脂肪酸, 细胞PKB/Akt水平随给药剂量的增加而降低[9]。将十八烯酸给予荷人胃癌组织的SCID小鼠, 移植瘤P13K水平随给药剂量增加而降低[10]。PI3K-Akt信号转导通路又受局部粘着斑激酶(FAK)调控, 这对研究肿瘤细胞增殖的调控机制提供了一条新的线索。

据文献报道, 甘肃省肿瘤发病率已经达到240人每10万人, 其中胃癌发病率和死亡率一直居高不下,严重影响着地方经济的发展与人们的身心健康。为了寻找预防和治疗胃癌的天然药物, 减轻药物对病人的毒副作用,本文选用从甘肃猫儿眼()块根中提取分离出的不饱和脂肪酸(USFA), 给予人胃癌细胞, 探讨FAK基因在人胃癌细胞PI3K-Akt信号通路中的调控作用, 为肿瘤的预防和治疗寻找新的药物资源提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌细胞(甘肃省医学科学研究院), 不饱和脂肪酸(USFA, 兰州大学化工学院天然植物研究所), 胎牛血清(郑州九龙生物制品有限公司), 5-氟尿嘧啶 (5-FU, 上海曙灿实业有限公司), 二甲基亚砜(DMSO, 天津光复精细化工研究所), FAK、Akt试剂盒(北京索宝生物科技有限公司), 3552-2型全自动高温灭菌CO2培养箱(SHELDON MFG INC.), 酶标仪, MULTISKAN 3(Thermo), 超净工作台(上海智城有限公司), 奥林巴斯数码显微镜(Olympus(中国)有限公司), 流式细胞仪(USA)。

1.2 方法

1.2.1 人胃癌细胞培养

取人胃癌细胞用含10%的胎牛血清、2 mmol·L–1谷氨酰胺、1×105U·L–1青霉素-链霉素的RPMI1640培养液, 在37℃、5%CO2培养箱中传代培养。

1.2.2 酶联免疫吸附法(ELISA)检测USFA对人胃癌细胞基因表达的水平

取人胃癌细胞液(含2×106个·L–1细胞), 加入96孔板, 每孔90 µL。给药组分为低剂量组(L): 每孔加入0.2 mg·L–1USFA(用DMSO助溶加RPMI1640培养液配制, DMSO含量≤30 µL·L–1, 其余同) 10 µL; 中剂量组(M): 每孔加入0.8 mg·L–1USFA 10 µL; 高剂量组(H): 每孔加入1.6 mg·L–1USFA 10 µL; 5- FU组: 每孔加5-FU(10 mg·L–1)10 µL; 对照组(C): 每孔加DMSO(30 µL·L–1)10 µL。5%CO2, 37 ℃, 饱和湿度条件中培养48 h,用酶标仪在450 nm处测检测各组细胞吸光度(OD), ELISA法测FAK、Akt表达水平。

1.2.3 流式细胞仪检测USFA对人胃癌细胞分裂周期的影响

取人胃癌细胞液2 mL, 加入含RPMI1640液6 mL的培养瓶, 给药组分别加入USFA 0.2,0.8,1.6 mg·L–1和5-Fu各0.8 mL; 对照组加DMSO(30 µL·L–1)0.8 mL, 培养48 h, 离心收集细胞, 用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 直线回归方程制作

以FAK、Akt标准品的浓度为横坐标, 吸光度(OD)为纵坐标作出标准曲线的直线回归方程。

1.2.5 统计学处理

实验数据用SPSS 22.0软件进行统计, 组间差异用单因素方差进行分析,<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人胃癌细胞凋亡率

流式细胞仪检测, 低、中、高3个浓度实验组人胃癌细胞凋亡率与给药浓度呈正相关; 高剂量给药组细胞凋亡率比5-FU组升高18.59%(<0.05), 低、中剂量组细胞抑制率与5-FU组接近。

表1 人胃癌细胞的凋亡率

注： L-USFA 0.2 mg·L–1; M-USFA 0.8 mg·L–1; H-USFA 1.6 mg·L–1; 5-FU-10 mg·L–1; C-DMSO 10 µL; 下同。

2.2 人胃癌细胞FAK表达水平

FAK直线回归方程:=1.5×10–2+1.1×10-2,2=0.9994。将各组细胞吸光度(OD)代入方程, 低、中、高浓度实验组和5-FU组的FAK水平分别为81.67±0.41, 48.33±0.19, 32.67±0.18和54.1±0.33, 比对照组FAK水平(91.67±0.22)分别降低了32.72%、47.28%、64.36%和41.08%,差异有统计学意义(=6.02,<0.01)见图1。

2.3 人胃癌细胞Akt表达水平

Akt直线回归方程: Y=1.19×10–2x+2.32×10-2, R2=0.9996。将各组细胞吸光度(OD)代入方程, 低、中、高浓度实验组和5-FU组的Akt水平分别为72.61±0.22, 57.06±0.45, 40.25±0.53和58.74±0.22, 比对照组Akt水平(87.73±0.36)分别降低了28.63%、34.96%、54.39%和33.21%, 差异有统计学意义(=8.934,<0.01)见图2。

图1 人胃癌细胞FAK表达的水平(与C组比: **P<0.01)

Figure 1 FAK expression level in human gastric cancer cells (**<0.01C group)

图2 人胃癌细胞Akt表达水平(与C组比: **P<0.01)

Figure 2 Akt expression level in human gastric cancer cells (**<0.01C group)

3 讨论

流行病学研究发现, 不饱和脂肪酸(USFA)具有改善肿瘤患者术后营养状态[11],降低肿瘤发病率[12], 抑制肿瘤生长[13]、诱导细胞凋亡[14]的作用。其通过影响脂质代谢调控基因的表达[15],增强免疫功能, 提高抗感染、抗肿瘤能力[16]。郭佳钰等[17]报道, USFA通过改变肿瘤细胞膜结构、损伤细胞内线粒体, 导致肿瘤细胞凋亡, 抑制PKB/Akt活性[9]。将十二碳烯酸给予人神经胶质细胞(H4)[18], G0G1期细胞数比对照组明显增加, G2M期细胞显著减少, 起到抑制细胞分裂增殖和促进细胞凋亡的作用。Corti等报道[19], 肿瘤生长或抑制受磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的调节和控制[20]。PI3K-AKT信号通路活性发生变化, 不仅能引起细胞恶性转化,在肿瘤血管生成和细胞生长,增殖,新陈代谢、迁移、分化和凋亡过程中起着至关重要的作用[21]。粘着斑激酶(FAK)[22]、PI3K[23]在肿瘤组织中的表达强度高于正常组织, 其对细胞生存[24]、粘着、游走过程中起着至关重要的作用[25]。CAO Weiguo等[26]研究发现, PI3K/Akt信号通路被激活时, 促进肿瘤细胞增殖。LI Jiyou等[27]报道, FAK活性增强时, 细胞分裂、侵染能力增加, 细胞凋亡率降低[28]。Vengatesen[29]给予FAK抑制剂, FAK表达水平降低, 细胞分裂过程被抑制, G0/G1期、G2/M期细胞比率增加, S期细胞比率下降, 进入分裂期细胞减少, 起到抑制细胞分裂的作用。本研究给予肿瘤细胞不饱和脂肪酸(USFA)处理后, 细胞中PI3K、p53基因表达下调[10], MDM2、p21基因表达明显上调[9], FAK和Akt水平显著下降, 细胞凋亡率随给药剂量的增加而升高, 其中G0/G1、S期细胞比例增加, G2/M细胞比例明显减少, 进入分裂期的细胞减少, 细胞分裂增殖被抑制。实验结果与以上学者报道结果一致。实验结果表明, USFA抑制人胃癌细胞增殖, 与下调PI3K-Akt信号通路中FAK、Akt水平、抑制人胃癌细胞分裂周期有关。

本研究将甘肃猫儿眼(甘遂)提取分离出不饱和脂肪酸并对人胃癌细胞增殖抑制作用以及对PI3K-Akt信号通路中相关基因表达的影响进行了实验研究, 不仅为预防和治疗肿瘤提供了新的药物资源, 而且为进一步研究不饱和脂肪酸抗肿瘤作用的机制积累了资料。

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Effects of unsaturated fatty acid on the expression of related genes in PI3K-Akt signaling pathway of human gastric cancer cells

YU Farong1, LI Jianjun1, YU Xin2, LIAN Xiuzhen1, XIE Mingren1,*, LI Denglou1

1. Key Laboratory of Evidence of Science and Technology Research and Application, Gansu University of Political Science and Law, Lanzhou 730070, China; 2. Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, US

In order to study the effects of USFA on the expression of related genes in PI3K-Akt signaling pathway in human gastric cancer cells, 2×106cell·L-1human gastric cancer cells were inoculated into 96-well culture plates, each with 90 µL. Three concentration groups: 0.2,0.8,1.6 mg·L-1USFA 10 µL, 5-FU group: 10 mg·L-15-FU 10 µL, control group: DSMO(30 µL·L-1)10 µL for each hole were set up at 37℃ and 5% CO2saturated humidity conditions in 48 h. The apoptosis rate of human gastric cancer cells was measured by flow cytometry. Focal adhesion kinase (FAK) and Akt expressions in gastric cancer cells were detected by ELISA. The results showed that the apoptosis rates of human gastric cancer cells were 17.42%, 23.23% and 26.24% after being cultured for 48 h with 0.2,0.8,1.6 mg·L-1USFA, compared with the control group(<0.05,<0.01). The levels of FAK and Akt were decreased by 10.91%, 47.28%, 64.36% and 17.33%, 34.96%, 54.39%, respectively, compared with the control group(<0.05,<0.01). The results showed that the USFA had obvious inhibitory effect on the proliferation of human gastric cancer cells, and its mechanism was related to the inhibiting cell division cycle of human gastric cancer cells and down-regulating levels of FAK and Akt in the PI3K-Akt signaling pathway.

unsaturated fatty acid; human gastric cancer cells; cell division cycle; apoptosis; PI3K-Akt signaling pathway

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.06.009

R961.1

A

1008-8873(2019)06-060-04

2019-06-03;

2019-08-08

甘肃省自然科学基金项目(17JR5RA158); 甘肃省高校科技创新团队项目(2016C-09); 兰州市人才创新创业项目(2016-RC-85); 兰州市科技计划项目(2018-1-17; 2019-1-48); 西北民族地区侦查理论与实务研究中心基金资助项目; 甘肃省证据科学特色学科项目

俞发荣(1959—), 男, 博士, 研究员, 主要从事生物与环境、药理学、毒理学以及实验动物学研究, E-mail: tim9898@163.com

谢明仁, 男, 硕士, 副教授主要从事法医生物学教学与研究, E-mail: xmr6700@gsli.edu.cn

俞发荣,李建军,YU Xin, 等. 不饱和脂肪酸对人胃癌细胞PI3K-Akt信号通路中相关基因表达的影响[J]. 生态科学, 2019, 38(6): 60-63.

YU Farong, LI Jianjun, YU Xin, et al. Effects of unsaturated fatty acid on the expression of related genes in PI3K-Akt signaling pathway of human gastric cancer cells[J]. Ecological Science, 2019, 38(6): 60-63.