348份小麦种质中抗条锈病基因 Yr5、 Yr10和 Yr18的分子标记检测与分布

董 娜，胡海燕，胡铁柱，李 淦，李小军，陈向东，张亚娟，茹振钢

(河南科技学院 小麦中心，现代生物育种河南省协同创新中心，河南省高等学校作物分子育种重点开放实验室，河南新乡 453003)

小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的真菌病害，具有流行速度快、分布范围广等特点，在中国曾发生多次大流行，是严重影响小麦生产的重要常发病害之一[1]。一般流行年份小麦减产10%～20%，较大流行年份减产超过30%，严重的甚至颗粒无收。如2002年全国小麦条锈病大流行，发病面积近670万hm2，遍及甘、陕、川、渝、云、贵、宁、鄂、豫、鲁、冀11个省(区)，小麦产量损失约10亿kg[2]。

实践证明，培育和利用抗病品种是控制小麦条锈病最经济、有效和环境安全的措施[3-5]。迄今，国际上已发现100多个抗小麦条锈病基因，正式命名编号至Yr79[6-7]。然而，由于小麦条锈菌群体结构复杂，新毒性小种不断形成，抗病基因会因为条锈病菌毒力频率变化或新的毒力型的出现而丧失抗性[8-9]。例如，Yr1、Yr2、Yr6、Yr7、Yr8、Yr9、Yr17等在中国已丧失抗性，最近几年由于条锈病菌新致病类型V26(目前未正式命名)的出现，Yr24/Yr26类抗源也丧失抗性[10]。因此，发掘新的抗条锈病基因，拓宽抗性基因遗传资源，对中国小麦抗条锈病育种至关重要。

国内学者在抗条锈病基因有效性评价和抗病种质资源筛选方面开展了大量基础性工作。王树和等[11]利用苗期抗病性鉴定和分子标记技术，评价了100个四川省近年小麦生产品种和后备品种对条锈菌流行小种的抗性水平，以及Yr5、Yr9等已知基因在该地区的分布状况。孙建鲁等[12]对100个小麦品种资源进行了抗条锈性鉴定和重要抗条锈病基因的SSR检测，从中筛选出具有稳定抗病性的品种8个。侯璐等[13]通过苗期分小种接种和大田成株期自然诱发，对81份春小麦种质资源的抗条锈性进行评价，鉴定出全生育期抗性资源7份，成株期抗性资源39份。曾庆东等[10]利用当前流行频率最高的条锈菌生理小种CYR32和CYR33，以及对Yr26有毒性的新菌系V26/CM42，通过对携带已知抗条锈病基因的小麦材料进行苗期和成株期抗病性鉴定，评估了各已知Yr基因在中国抗条锈病育种中的有效性。韩德俊等[14]通过对1 980份小麦地方品种和国外种质进行抗条锈性鉴定与评价，筛选出具有全生育期抗性的种质8份，具成株期抗性的种质42份。李峰奇等[15]通过对黄淮麦区126个小麦品种(系)进行条锈病抗性鉴定和抗病基因分子标记检测，发现黄淮麦区小麦品种对当前条锈菌流行小种的抗性水平较低，对新小种抗性良好的Yr5、Yr10等基因分布频率很低。这些研究对小麦抗条锈病育种具有重要意义。

小麦抗条锈病基因Yr5、Yr10和Yr18对当前条锈病流行小种仍保持一定抗性。因此，本研究利用与抗条锈病基因Yr5、Yr10和Yr18共分离或紧密连锁的分子标记S1320[16]、SC200[17]和csLV34[18]，对河南科技学院小麦中心收集的348份小麦种质进行检测，了解现有育种材料中抗性基因Yr5、Yr10和Yr18的分布状况，同时结合田间鉴定对种质材料的抗病性进行评价，以期为小麦抗条锈病材料的合理利用以及抗条锈病基因聚合育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 小麦种质与条锈病菌 348份小麦种质均为育成品种(系)，由河南科技学院小麦中心收集和保存，其中114份来源于河南省各育种单位，其余234份收集于全国多个麦区。条锈病菌为生产上流行小种CYR32和CYR33混合菌株，购自中国农科院植保所。

1.1.2 主要试剂与仪器 2×TaqMaster Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司；Gene Amp PCR System 9700型PCR仪购自ABI；试验所用的分子标记引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，其序列见表1。

表1 标记及序列Table 1 Markers and their sequences used in this research

1.2 方 法

1.2.1 小麦种质的种植及条锈病抗性调查 所有小麦种质均种植于河南科技学院小麦中心位于新乡市辉县的种质圃中，每份种质播种两行，行长4 m，畦埂上种诱发行(‘石家庄8号’)，常规田间管理，第二年春季小麦返青后取样检测。于3月中下旬小麦拔节期，采用孢子悬液注射法进行条锈菌接种，每行接种1个分蘖，灌浆初期调查条锈病发病情况，病级划分采用0～4级法[19]。条锈病抗性于2014-2017年连续调查3 a，病级按发病最重的统计。

1.2.2 基因组DNA提取 取0.2 g左右小麦幼苗叶片放入1.5 mL离心管中，液氮冷冻研磨后，采用CTAB法[20]提取基因组DNA，DNA提取效果通过10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 分子标记检测 PCR反应体系为20 μL，包括2×TaqMaster Mix 10 μL，10 μmol/L特异引物各0.5 μL，DNA模板50～100 ng，剩下用ddH2O补足。S1320的扩增程序为94 ℃预变性5 min，(94 ℃变性50 s、60℃退火50 s、72 ℃延伸50 s)×36，72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存；扩增产物在170V下经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h左右，银染、显影后利用凝胶成像仪观察电泳结果并拍照保存。SC200和csLV34的扩增程序为94℃预变性5 min，(94 ℃变性50 s、55 ℃退火50 s、72 ℃延伸50 s)×36，72 ℃终延伸10 min， 4 ℃保存。扩增产物在110 V下经10 g/L琼脂糖凝胶(含goldview染料)电泳40 min左右，然后利用凝胶成像仪观察电泳结果并拍照保存。

2 结果与分析

2.1 Yr5基因的分子标记检测

检测Yr5基因用的是与其共分离的SCAR标记S1320，携带Yr5基因的种质能够扩增出156 bp的DNA条带(图1)。检测结果表明，在348份小麦种质中能够扩增出目标DNA条带的有122份，说明这122份种质携带有Yr5基因，其余226份种质中未扩增出预期大小的DNA条带，说明这些种质未携带该基因，检出率为35.06%。

M.100 bp marker；1～36.部分检测样品 Partial samples detected；37.阳性对照 Positive control；箭头所指为目标条带 The arrow shows the target band

图1Yr5基因的分子标记检测结果
Fig.1 PCR pattern amplified by SCAR marker ofYr5

2.2 Yr10基因的分子标记检测

检测Yr10基因用的是与其紧密连锁的SCAR标记SC200，二者的连锁距离为0.5 cM，携带Yr10基因的种质能够扩增出大小约200 bp和180 bp的两条DNA条带，未携带该基因的种质只能扩增出约180 bp的一条带(图2)。在检测的348份小麦种质中，能够扩增出目标DNA条带的有80份，说明这80份种质携带有Yr10基因，其余268份种质没有扩增出预期大小的DNA条带，说明这些种质未携带该基因，检出率为22.99%。

2.3 Yr18基因的分子标记检测

利用与Yr18基因紧密连锁的STS标记csLV34对其进行分子检测，二者的连锁距离为0.4 cM，携带Yr18基因的种质能够扩增出150 bp的DNA条带，未携带该基因的种质扩增的条带为229 bp(图3)。检测结果表明，在348份小麦种质中能够扩增出目标DNA条带的有7份，说明这7份种质携带有Yr18基因，其余341份种质没有扩增出预期大小的DNA条带，说明这些种质未携带该基因，检出率为2.01%。

M.100 bp marker；1.阳性对照 Positive control；2～24.部分检测样品 Partial samples detected；箭头所指为目标条带 The arrow shows the target band

图2Yr10基因的分子标记检测结果
Fig.2 PCR pattern amplified by SCAR marker ofYr10

2.4 含 Yr5、 Yr10和 Yr18种质的条锈病抗性分析

条锈病抗性鉴定结果表明：携带Yr5的122份种质中，表现中抗及以上的有27份，所占比例为22.13%，其中‘CP02-8-5-6-2-1’‘内麦9号’‘黔9963-3’‘农大189选’‘CP20-38’‘07Bh032’和‘B70041-1-2’表现近免疫；携带Yr10的80份种质中，表现中抗及以上的有11份，所占比例为 13.75%，其中‘渝0822’表现近免疫；携带Yr18的7份种质中，有3份表现中抗及以上，所占比例为 42.86%，其中‘07Bh032’和‘CA57’表现近免疫(表2)。从这些结果可以看出，携带抗病基因的种质中抗病性表现并不一致，Yr18的抗性较为稳定，其次为Yr5，而Yr10仅在少数遗传背景中具有抗性。

M.100 bp marker；1.阳性对照 Positive control；2～24.部分检测样品 Partial samples detected；箭头所指为目标条带 The arrow shows the target band

图3 Yr18基因的分子标记检测结果Fig.3 PCR pattern amplified by STS marker of Yr18

注：“√”代表阳性；下同。

Note: “√” represents positive; the same below.

在检测的348份种质中，抗病基因聚合种质有37份，其中Yr5、Yr10和Yr183基因聚合的种质1份，Yr5和Yr10聚合的种质32份，Yr5、Yr18聚合和Yr10、Yr18聚合的种质各2份(表3)。抗病基因聚合种质的条锈病抗性鉴定结果表明：在Yr5和Yr18聚合时，条锈病抗性表现较好，2份种质中‘09P131’表现中至高抗，‘07Bh032’表现近免疫。含有Yr10的各类聚合种质共35份，其中Yr5和Yr10聚合的32份种质中仅‘陕农981’‘抗赤6号’和‘抗白3号’表现中抗，其余表现中至高感，Yr10、Yr18聚合的2份种质和Yr5、Yr10、Yr183基因聚合的1份种质均表现中至高感，说明Yr10和Yr5或Yr18聚合后没有有效提高这些种质的条锈病抗性。

表3 抗病基因聚合种质及其抗病性Table 3 The wheat germplasms carrying pyramiding disease resistant genes and their disease resistance

此外，有10份种质‘内麦836’‘丰优7号’‘川农05152’‘W3734’‘09品E2’‘农大8P593’‘CP02-9-2-2’‘CP02-3-5-5’‘04中77’和‘云麦57’，虽然未检出上述3个基因，但是对条锈病表现近免疫，这些种质主要来自四川、北京和云南等地，是抗条锈病育种的重要资源，后续会进行深入研究。

2.5 348份种质中 Yr5、 Yr10和 Yr18的分布

共检测3个小麦抗条锈病基因Yr5、Yr10和Yr18，在这348份小麦种质中，Yr5的检出率最高，主要分布在安徽、宁夏、陕西、山东、江苏等省的种质中，安徽和宁夏种质中Yr5的检出率达到了100%，可能跟这些地方搜集的种质较少有关；其次是Yr10，主要分布在内蒙、安徽、山东、陕西、河北的种质中；Yr18的检出率最低，仅有7份种质携带该基因，分布于江苏、北京和山东的种质中(表4)。从3个基因的总体分布来看，陕西、河南、山东、江苏、河北和北京来源的种质中抗病基因分布较多，抗病基因聚合种质也较多，其中含抗病基因且表现抗病的种质则主要来自陕西、北京和江苏(表2、3、4)。

表4 348份种质中 Yr5、 Yr10和 Yr18的分布情况Table 4 The distribution of Yr5, Yr10 and Yr18 among 348 wheat germplasms

注：“-”代表无。

Note: “-” represents none.

3 讨论与结论

种质资源抗病性的有效评价是小麦抗病育种的重要基础，基于PCR的分子标记技术的发展，为种质资源中抗病基因组成的快速鉴定提供了有效手段，在辅助育种中已有较多应用。本研究通过分子标记辅助检测，初步明确了河南科技学院小麦中心保存的348份种质中抗条锈病基因Yr5、Yr10和Yr18的分布情况，并结合田间鉴定对这些种质的条锈病抗性进行了评价。

STS标记csLV34在辅助检测抗条锈病基因Yr18中已有较多应用。杨文雄等[21]、白小军等[22]、任妍等[23]、伍玲等[24]用该标记从种质资源中鉴定携带Yr18的材料，分子标记检测阳性的种质对条锈病具有较好的抗性。董娜等[19]也曾用该标记从39份外引种质中鉴定出6份携带Yr18的种质，且对条锈病菌表现近免疫至中抗。但本研究中，标记csLV34阳性的7份种质抗病性表现并不一致，表现中抗及以上的只有3份。在用SCAR标记S1320和SC200检测Yr5和Yr10时，标记阳性的种质抗病性表现也不一致。标记S1320阳性的122份种质中表现中抗及以上的有27份，标记SC200阳性的80份种质中，表现中抗及以上的有11份，与之前用这些标记检测外引种质的结果类似。韩德俊等[14]在利用紧密连锁的分子标记STS7/8对抗条锈病基因Yr5进行检测，王树和等[11]在用SCAR标记Yr10F/R对Yr10基因进行检测时均发现标记阳性种质抗病性表现不同的情况。因此，利用这些分子标记进行辅助育种时，必须结合接种鉴定的结果综合判断。同时也期待随着分子标记技术的发展，开发出越来越多稳定可靠的抗病基因功能标记用于辅助育种。

在检测的3个抗条锈病基因中，慢锈性基因Yr18的检出率最低，348份种质中仅有7份携带该基因，这与杨文雄等[21]、李敏州等[25]、Zeng等[26]的研究结果基本一致。Yr18在中国育成品种(系)分布频率低跟过去在品种选育中过分强调高抗或免疫的主效基因的选择，忽视了慢病基因的利用有关。从抗病基因聚合种质的抗病性鉴定结果来看，Yr5和Yr18聚合时抗病性表现非常好，Yr10与Yr5或Yr18聚合则不能有效提高种质的抗病性，在小麦抗条锈病育种中可以通过将Yr5与Yr18聚合来提高小麦品种的条锈病抗性以及延缓抗病品种的使用寿命。从抗病种质的分布来看，含抗条锈病基因Yr5、Yr10或Yr18且表现抗病的种质主要来自陕西、北京和江苏，收集于小麦主产区河南的种质最多，但含上述抗病基因且表现抗病的种质则较少，因此还需进一步加强适于小麦主产区的抗条锈病种质的创制与利用。