拟南芥 AtNHX5基因启动子的克隆和组织定位分析

李静雯，厚毅清，陈 军，朱天地

(甘肃省农业科学院 生物技术研究所，兰州 730070)

维持胞内离子和pH稳态对细胞的活动和功能至关重要[1-2]。已有研究表明，植物Na+、 K+/H+反向转运体(NHX)对维持细胞内离子平衡和调节pH平衡具有重要作用，并在各种细胞过程中扮演重要角色，包括逆境响应、膜微囊运输、蛋白存贮、细胞生长、渗透调节、Na+和 K+离子运输及生长与发育等生理生化过程[3-7]。NHX是一类跨膜反向转运蛋白，属于一价阳离子/H+反向转运体(cation/proton antiporter，CPA)基因家族中的CPA1亚家族，生化活性是将Na+或K+与质子(H+)进行跨膜反向转运，在酵母、细菌、植物和动物等生物体内广泛存在[8-9]。

植物NHX基因家族分为三类，即质膜NHXs，液胞NHXs和内膜NHXs。模式植物拟南芥中NHX基因家族包含8个成员，其中质膜NHXs(AtNHX7/SOS1、AtNHX8)、液胞NHXs(AtNHX1-4)研究的相对较早，且对AtNHX7/SOS1的调节机制研究最为清楚[10-15]。拟南芥内膜AtNHX5和AtNHX6基因编码的反向转运体定位在高尔基、反面高尔基体管网状结构(TGN)、内质网(ER)和液胞前体(PVC)[4,16-17]。有研究表明，AtNHX5既能抑制酵母突变体nhx1对潮霉素和盐胁迫的敏感性，又能增加对Li+的耐受性，在拟南芥中内膜NHXs调节胞内和内膜系统内的pH及离子平衡[16]，影响囊泡运输和蛋白存贮[18-20]，并通过调节生长素影响植株生长和发育[3-4]，这些结果说明，与拟南芥质膜和液胞NHXs而言，内膜NHXs具有独立功能，是NHX家族的重要组成部分。目前对拟南芥AtNHX5的亚细胞定位、功能已进行初步研究，但对其启动子及组织表达模式的研究较少，基于此，本研究克隆AtNHX5基因启动子并进行序列分析，通过农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，并利用GUS染色检测研究AtNHX5基因在植株不同组织中的表达特性。 以期探明AtNHX5在拟南芥幼苗和成株各组织内的表达强弱情况，为进一步探寻AtNHX5在离子转运和pH调节中的作用和调控机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料及生长条件

野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)为Col-0 。所用植物材料生长室温21 ℃，光强100 μmol/(m2·s)，光周期为16 h/8 h(光照/黑暗)，相对湿度50 %± 10 %。无菌材料培养，先用φ=20 %的次氯酸钠将种子表面消毒13 min，再用无菌蒸馏水漂洗6次，然后点种在含有10 g/L琼脂，pH 5.8的MS固体培养基中，置于4 ℃冷藏箱中暗处春化3 d后转入温室萌发生长。需完成整个生长周期的材料，在萌发生长7 d后移入营养土内，置于温室内培养。

1.2 菌株、载体

所用大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101，均由甘肃省农业科学院生物技术研究所遗传工程实验室保存提供。所用植物表达载体为pCAMBIA1391。

1.3 引 物

试验所用各引物序列见表1，引物序列利用软件Primer Premier 5设计。

表1 试验所用引物序列Table 1 Primers used in experiment

注：引物PRNHX5-F和PRNH5-R下划线序列分别为SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点。

Note:Underline sequences of PRNHX5-F and PRNH5-R wereSalⅠ andEcoRⅠrestricyion sites,respectively.

1.4 DNA提取及 AtNHX5基因启动子克隆

以野生型拟南芥Col-0为材料，用生工植物基因组提取试剂盒从中提取拟南芥基因组DNA。根据TAIR网站公布的拟南芥基因组数据，选取AtNHX5基因开放阅读框(ORF)上游1 807 bp启动子序列，运用引物设计软件Primer Premier 5设计特异性引物PRNHX5-F和PRNHX5-R，并根据表达载体和启动子序列内酶切位点在引物5′端分别添加SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点及保护碱基，引物序列由华大基因公司合成。以获得的拟南芥基因组DNA为模板，用高保真酶进行PCR扩增，扩增后的PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收并纯化。

1.5 AtNHX5基因启动子序列分析

利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线软件对AtNHX5基因转录起始位点前1 807 bp的启动子序列进行分析，预测顺式作用元件。

1.6 载体构建及植株转化、筛选

用NEB的SalⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶分别双酶切表达载体pCAMBIA1391质粒和PCR产物，并回收目的片段。利用promage公司T4连接酶将回收的PCR目的产物构建到表达载体pCAMBIA1391上并转入大肠杆菌扩增，获得GUS(β-半乳糖苷酶)表达载体pCAMBIA1391-proNHX5-GUS。经PCR扩增、酶切及测序鉴定正确的表达载体转入农杆菌GV3101。农杆菌在YEP固体培养基培养，YEP培养基成分为： 5 g/L牛肉膏，1 g/L酵母提取物，5 g/L蛋白胨，5 g/L蔗糖，4 g/L MgSO4·7H2O，15 g/L琼脂，pH 7.4。通过PCR鉴定获得转入成功的农杆菌菌株，并通过花序浸染法转染到野生型拟南芥中[21]。转基因材料在含有50 mg/L的潮霉素(Hygromycin B)的MS培养板上进行筛选，选用启动子测序所用正向引物C-PRNHX5-F2和GUS基因内特异反向引物GUS-R对抗性筛选获得株系进行PCR鉴定，以便确定所选株系中存在融合目的基因序列。获得的第3代转基因植株的3个独立的纯合体株系用于GUS染色分析。

1.7 GUS染色分析

选用生长在MS培养基上的整株幼苗和盆栽成熟植株的不同组织进行GUS组织化学检测分析。选取的材料浸透在染色液(100 mmol/L 磷酸缓冲液， pH 7.0，1.9 mmol/L 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸， 0.5 mmol/L 铁氰化钾， 0.5 mmol/L亚铁氰化钾，φ=0.1% Triton X-100，10 mmol/L EDTA 和φ=20 %甲醇)中，于37 ℃过夜染色后去掉染色液，加入φ=70 %乙醇用于脱去叶绿素。去净叶绿素的材料在体视显微镜下观察照相。

2 结果与分析

2.1 拟南芥 AtNHX5基因启动子的克隆及顺式作用元件分析

根据已知拟南芥基因组序列信息，设计带有特异酶切位点和保护碱基的引物，正向扩增引物PRNHX5-F含有SalⅠ酶切位点，反向扩增引物PRNHX5-R含有EcoRⅠ酶切位点，以拟南芥Col-0基因组DNA为模板，采用高保真酶进行PCR扩增，PCR产物大小为1 825 bp。将扩增产物进行核酸电泳检测，结果表明扩增条带符合预期大小(图1)。

对proNHX5分析发现，序列中除了包含启动子典型的核心元件TATA-box和CAAT-box等外，还包含AE-box、Box 4、GA-motif、GT1-motif、TCT-motif光响应元件；ABA响应元件ABRE；茉莉酸甲酯响应元件CGTGA-motif和TGACG-motif；生长素响应元件TGA-element；分生组织表达调控元件CAT-box；厌氧诱导的必须调控元件ARE和防御与应激相关元件TC-rich repeats(表2)。

M.DNA marker D2000; proNHX5.AtNHX5启动子序列AtNHX5promoter sequence

图1AtNHX5基因启动子的克隆
Fig.1 Clone ofAtNHX5gene promoter

表2 AtNHX5启动子区域顺式作用元件预测Table 2 Prediction of cis-acting elements in promoter of AtNHX5

2.2 pCAMBIA1391-proNHX5-GUS启动子表达载体的构建及鉴定

如图2-A，为了研究AtNHX5基因启动子的活性和组织表达模式，将启动子扩增产物proNHX5和植物表达载体pCAMBIA1391分别用NEB的SalⅠ和EcoRⅠ双酶切后连接，经菌落PCR和质粒酶切验证获得正确的重组质粒pCAMBIA1391-proNHX5-GUS。DH5α菌落PCR扩增产物大小为1 825 bp，与预期结果相一致(图2-B)。由于在构建中连接部位为SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点，重组成功的质粒单酶切后电泳应有一条大小为12 454 bp的目的条带，而双酶切后电泳应有一条大小分别为10 641 bp的线性质粒条带和一条1 813 bp与proNHX5几乎一致的序列条带，酶切试验结果符合预期，说明AtNHX5启动子成功克隆到pCAMBIA1391载体中(图2-C)。通过进一步测序验证，证实测序序列结果与数据库序列一致。

A：pCAMBIA1391-proNHX5-GUS表达载体构建示意图 Map of construction of pCAMBIA1391-proNHX5-GUS expression vector；B：pCAMBIA1391-proNHX5-GUS表达载体的PCR分析 PCR analysis of pCAMBIA1391-proNHX5-GUS vector；M.DNA marker D2000；+.proNHX5启动子序列AtNHX5promoter sequence; 1～5.载体转化大肠杆菌菌液PCR产物 PCR product of fusion expression vector transformed intoE.coliDH5α；-.阴性对照 Negative control；C：pCAMBIA1391-proNHX5-GUS表达载体酶切鉴定 Identification of promoter analysis vector pCAMBIA1391-proNHX5-GUS by digestion；M.DNA marker D15000；S1.EcoRI单酶切 Single-digestion products byEcoRI；S2.SalI和EcoRI双酶切 Double-digestion products byEcoRI andSalⅠ；+.proNHX5启动子序列AtNHX5promoter sequence

图2AtNHX5启动子载体构建
Fig.2 Vector construction ofAtNHX5promoter

2.3 拟南芥转基因植株的获得

将测序正确的重组质粒转化农杆菌GV3101，在含有Rif和Kan抗生素的YEP固体培养基上筛选，挑取单菌落，通过菌落PCR筛选，能够扩增出与proNHX5启动子克隆序列大小一致的条带为成功导入表达载体的阳性菌株 (图3)。获得的阳性农杆菌通过花序浸染法转化拟南芥Col-0，将得到的T0代种子经消毒后播种于含有潮霉素的MS培养基中进行筛选，具有抗性的植株经PCR检测为阳性的单株收获种子并加代，获得T3代纯合转基因株系(图4)。

M.DNA marker D2000；+.阳性对照 Positive control；1～8.载体转化农杆菌菌液PCR产物 PCR product of expression vector transformed intoE.coliDH5α; -.阴性对照 Negative control

图3 农杆菌菌液PCR鉴定
Fig.3 PCR detection of agrobacterium tumefaciens

M.DNA marker D2000；+.阳性质粒对照 Positive control; 1～7.转基因植株 Transgenic fusionArabidopsis; -.野生型对照 Wild type

图4 转基因拟南芥植株的PCR
Fig.4 PCR analysis of transgenicArabidopsis

2.4 AtNHX5启动子在拟南芥中的表达分析

为检测基因的组织表达模式，分别选取培养基上萌发生长1 d、2 d、3 d、6 d、9 d、12 d的整株转基因拟南芥幼苗和盆栽生长45 d植株的茎、叶、花和果荚进行GUS组织化学染色。试验证明，3个独立的纯合转基因株系有着相似的表达模式。结果显示，由AtNHX5基因的启动子控制的GUS表达活性，在植株整个发育过程中一直都有表达(图5和图6)。萌发1 d到3 d的幼苗中，GUS活性在子叶和下胚轴中广泛表达，而种皮和胚根中未见表达(图5-A-图5-C)。随着幼苗生长，子叶和茎中GUS仍广泛表达，且子叶和茎中微管系统的GUS表达最为显著，真叶中仅局部检测到GUS表达，生长6 d、9 d和12 d 的转基因植株根中也只有局部区域检测到微弱GUS表达(图5-D-图5-F)。成熟植株中，茎中有明显的GUS表达(图6-A和图6-D)。在成熟叶片中，有的检测不到GUS的表达，有的仅叶尖局部检测到GUS表达(图6-B)。在花中，柱头、花柱、花柄和花瓣的微管中检测到GUS明显表达，花瓣部分区域微弱表达，而在花序顶端花苞未见GUS表达(图6-D)。在未成熟果荚中，GUS主要表达在果柄、果荚顶端和基部，早期幼嫩果荚表皮也有弱的表达，随着果荚发育，果荚表皮将检测不到GUS表达(图6-C和图6-D)。接近成熟果荚中，只有果柄有很微弱的GUS表达，果荚顶端和基部未见GUS表达(图6-C)。

A～F.生长1 d、2 d、3 d、6 d、9 d、12 d的转基因植株 Arabidopsis seedlings of 1 d 2 d,3 d,6 d,9 d,12 d

A.茎 Stem；B.叶 Leaf；C.果荚 Silique；D.花序与果荚 Inflorescences and sulique；E.花 Flower

3 讨 论

植物基因表达调控过程主要有DNA水平调控、染色体水平调控、转录调控、转录后调控、翻译调控和翻译后调控，在这些调控方式中，转录水平调控是最为主要的。启动子是位于结构基因上游的DNA序列，不仅决定基因转录方向和RNA聚合酶类型，还是转录水平上基因表达调控的中心[22]。在启动子区域，有很多在转录水平调控过程中具有重要作用的顺式作用元件，参与调控下游基因表达，从而调节生长发育和抵抗外界环境胁迫[23]。在启动子的核心启动子区域通常包含TATA-box和CAAT-box元件，也是启动子的特征序列。通过对AtNHX5基因开放阅读框上游序列分析，发现该序列中具有多个TATA-box和CAAT-box核心启动子元件，说明其具有典型启动子特征。

启动子除了具有典型的核心启动子元件外，还有众多与基因功能相关的调节元件或结合位点。因此，在相近基因的启动子序列中，应该存在很多一致的顺式作用元件。李红婷等[24]克隆分析醋栗番茄NHX4基因启动子发现，在启动子序列内含有多个与激素、逆境诱导相关元件和光反应相关元件。邹兰等[25]克隆的盐生草HgNHX1基因启动子中包含多个与非生物胁迫、植物激素诱导及光应答元件。本研究也得到类似结果，在AtNHX5基因启动子序列内发现多个光响应元件和激素、逆境诱导相关元件，另外，还发现分生组织表达调控元件(表2)。这些结果预示着AtNHX5基因的表达可能受到逆境胁迫、激素及光等信号的调控。有研究表明，AtNHX5作为重要的内膜Na+，K+/H+反向转运体，在应对盐胁迫、水分胁迫和钾营养代谢中具有重要作用[16,26-28]，同时，最新研究显示拟南芥内膜反向转运体参与生长素介导的生长与发育[3-4]，这都与启动子分析结果中的调节元件功能相一致，也预示着AtNHX5很可能在光响应、分生组织表达和茉莉酸调控中的作用还未被发现，值得进一步研究。

利用农杆菌介导法转化拟南芥，对获得的纯合体株系进行GUS组织化学染色，发现proNHX5正确启动GUS基因表达，说明克隆的proNHX5序列具有启动子活性。Bassil等[17]用荧光实时定量PCR(RT-qPCR)分析表明，AtNHX5和AtNHX6基因在拟南芥生长发育的各个阶段的很多组织内均有表达，包括花、花芽、茎、莲座叶、根和果荚，且不同组织存在表达差异,有报道对AtNHX6基因启动子进行分析，也得到类似结果[29]。本研究通过对幼苗期不同生长时间的植株GUS染色发现，proNHX5不仅正确启动GUS基因表达，而且使GUS在不同生长时间幼苗各个部位的表达强弱存在差异。在幼苗期，子叶和茎中从萌发第1天开始就有GUS表达，而根中早期并未检测到GUS表达，直到生长到的第6天，根中有些部位才开始检测到GUS表达(图5)。生长6 d、9 d、12 d的幼苗中发现，在茎顶端分生组织处有较强的GUS表达，且在第6天左右真叶开始长出，随着植株生长，真叶中GUS表达区域和强度逐渐变小和减弱，到成株时只在叶尖检测到微弱的GUS表达。前面启动子分析也发现，在proNHX5序列里内有分生组织表达调控元件存在，这正好与GUS在茎顶端分生组织强表达相一致，这也暗示根中出现GUS表达的部位很可能也与分生组织有关。虽然在根尖和侧根中未检测到GUS表达，但有报道显示，与AtNHX5高度同源且功能冗余的内膜反向转运体的另一个成员AtNHX6的启动子在根尖和侧根原基部位驱动GUS强表达[3,29- 30]，这可能是导致proNHX5驱动GUS表达在根中一些分生组织极不明显的原因。在成株中，茎中仍具有明显的GUS表达，而花中GUS表达随着生长发育发生变化，花序顶端花中未检测到GUS表达，而发育成熟花中具有明显的GUS表达，尤其雌蕊柱头、花柱和花瓣微管组织中。果荚中GUS也随果荚生长发育表现表达部位和强度差异，随着果荚发育从开始的果柄、果皮、果荚顶端和基部中明显GUS表达到仅在果柄有微弱表达。整个GUS染色结果显示，在拟南芥整个生长过程中，proNHX5驱动的GUS表达具有明显的时空特异性，预示着AtNHX5基因在拟南芥中也具有相同的表达模式，表明AtNHX5在拟南芥生长发育各个阶段都发挥着重要作用。