枇杷叶HPLC特征图谱研究及主要成分含量测定△

顾生玖，李鹤，，周艳林，邹节明，林昆，陈镜任，朱开梅*

1.桂林医学院 药学院，广西 桂林 541004；2.桂林三金药业股份有限公司，广西 桂林 541004

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.的干燥叶，又名巴叶、芦桔叶，具有清肺止咳，降逆止呕的功效，主治肺热咳嗽、气逆喘急、胃热呕逆、烦热口渴等症[1-3]。广泛分布于我国大部分地区，全年均可采收。枇杷叶含有黄酮类、三萜酸类、倍半萜类、有机酸类及多糖类[4]等成分，目前对枇杷叶品质的评价方法比较单一，通常以枇杷叶中三萜酸的含量作为评价指标，缺乏整体性评价。文献报道黄酮苷类成分具有较多的药理活性[5-6]，且又是枇杷叶的主要成分，因此开展了枇杷叶药材水溶性部位HPLC特征图谱的研究，并对其中金丝桃苷和槲皮苷进行含量测定，为枇杷叶药材及其复方制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260系列高效液相色谱仪，含在线真空脱气机(G-1311C)、二元泵(G-1311C)、标准自动进样器(G-1329B)、智能化柱温箱(G-1316A)、DAD检测器(G-4212B)、Agilent1260 Infinity色谱工作站(美国安捷伦公司)；Milli-Q Direct 8超纯水一体化系统(美国默克密理博公司)；XP404S型电子天平(瑞士Mettler公司)。

1.2 试药

绿原酸(批号：110753-201415，纯度96.2%)、金丝桃苷(批号：111521-201004，纯度98.0%)、异槲皮苷(批号：111809-201403，纯度98.0%)、槲皮苷(批号：111538-201105，纯度：98.0%)均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯；MCI GEL CHP 20填料购自日本三菱化学公司。

实验用的新鲜枇杷叶采自广西桂林，采集时间为2018年5月。采摘新叶(淡绿色且质地较软)300 g、成熟叶(绿色且质地适中)300 g、老叶(墨绿色且质地较硬)300 g、落叶(自然掉落的黄叶)300 g，自采药材于60 ℃烘干，粉碎成粗粉。10批枇杷叶药材购自于桂林中南药业有限公司，经钟小清高级工程师鉴定为蔷薇科常绿小乔木植物枇杷Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.的叶，批号分别为160101(S1)、160501(S2)、160701(S3)、160901(S4)、161001(S5)、161101(S6)、161201(S7)、170101(S8)、170401(S9)、170501(S10)。

2 特征图谱

2.1 色谱条件

采用资生堂CAPCELL PAK MG C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)为流动相进行梯度洗脱，流动相梯度为：0～60 min，10%→20%A；60～84 min，20%→28% A；84～118 min，28%→48% A；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：355 nm；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液制备 取绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含绿原酸0.36 mg、金丝桃苷0.03 mg、异槲皮苷0.02 mg、槲皮苷0.02 mg的混合对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 取枇杷叶药材粗粉2 g，加入70%乙醇50 mL，称定质量，加热回流提取2 h，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25 mL蒸干，残渣加水10 mL使溶解；将其通过MCI GEL CHP 20柱(内径为1 cm，柱高为10 cm)，以50 mL水洗脱，弃去水洗液，用50%乙醇50 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加80%甲醇适量使溶解，转移至2 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一份2.2.2项下供试品溶液，按2.1项色谱条件，连续进样6次，记录各共有峰的保留时间和峰面积。以4号金丝桃苷峰为参照峰S，结果各共有峰相对保留时间的RSD在0.02%～0.17%，相对峰面积比值的RSD在0.2%～0.7%，均小于2.0%，表明该仪器的精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取2.2.2项下供试品溶液分别于制备后0、4、8、12、18、24 h，按2.1项色谱条件进样测定，记录各共有峰的保留时间和峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD在0.01%～0.21%，相对峰面积比值的RSD在0.2%～0.9%，均小于2.0%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批药材(批号170101)分别制备6份供试品溶液，按2.1项色谱条件进样测定，记录各共有峰的保留时间和峰面积。结果各共有峰相对保留时间的RSD在0.02%～0.22%，相对峰面积比值的RSD在0.9%～1.7%，均小于2.0%，表明该方法的重复性良好。

2.3.4 耐用性试验

2.3.4.1 不同色谱柱对测定的影响 分别取2.2.2项下供试品溶液，选用CAPCELL PAK MG C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3根不同品牌的色谱柱，按2.1项色谱条件进样分析，均能达到枇杷叶药材特征图谱的测定要求。

2.3.4.2 不同仪器对测定的影响 实验选择安捷伦1260系列高效液相色谱仪、Waters e2695液相色谱仪和岛津LC-20A液相色谱仪，取2.2.2项下供试品溶液分别进样分析，结果3种仪器所得图谱均符合测定要求，表明不同仪器对供试品色谱峰的影响不大。

2.4 特征图谱的建立及共有峰的指认

2.4.1 特征图谱的建立 取10批及不同生长阶段的枇杷叶药材适量，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下进样分析，记录色谱图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》进行分析、比较，经多点校正和自动匹配后，生成对照特征图谱。共标定10个共有峰，选定这10个峰进行峰匹配，建立枇杷叶药材HPLC特佂图谱。

4号峰为对照品金丝桃苷，出峰时间适宜，峰形较好，故选择以金丝桃苷峰为参照峰S，其他9个色谱峰的相对保留时间分别为0.322 1、0.610 4、0.937 5、1.035 6、1.284 9、1.551 9、1.837 6、1.913 2和2.362 1，各共有峰相对保留时间的RSD在0.02%～0.39%，均小于2.0%，见图1。

注：R.对照图谱；S1～S10.批次。图1 不同批次枇杷叶药材的HPLC特征图谱

通过对不同生长阶段的枇杷叶药材的测定，结合《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》进行分析。以4号峰为参照峰，其他9个色谱峰的相对保留时间分别为0.322 9、0.610 7、0.938 2、1.034 8、1.282 7、1.551 4、1.836 7、1.912 3和2.359 6，其共有峰相对保留时间的RSD在0.13%～0.87%，均小于2.0%，见图2。

注：R.对照图谱；S1.干叶；S2.新叶；S3.成熟叶；S4.老叶；S5.落叶。图2 不同生长阶段枇杷叶药材的HPLC特征图谱

2.4.2 各共有峰的指认 取混合对照品溶液、枇杷叶药材适量，按2.2项下方法制备，在2.1项色谱条件下进样分析。结果表明，10批样品特征图谱的色谱峰均在118 min内全部出完，对所得特征图谱进行指认，选择稳定性、重复性好以及特征明显的色谱峰为共有峰，共标定了10个峰。其中1、4、5、6号峰分别为绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮苷，见图3。

注：S1.空白溶液；S2.混合对照品；S3.供试品溶液；1.绿原酸；4.金丝桃苷；5.异槲皮苷；6.槲皮苷。图3 枇杷叶供试品、混合对照品及空白溶液HPLC图

3 含量测定方法与结果

3.1 溶液的制备

3.1.1 混合对照品溶液制备 取金丝桃苷、槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含金丝桃苷0.034 2 mg、槲皮苷0.028 6 mg的混合对照品溶液，即得。

3.1.2 供试品溶液的制备 同2.2.2。

3.2 色谱条件

色谱条件同2.1，在此条件下，各待测组分与相邻峰之间的分离度均达到要求。空白溶液在与各待测组分相同保留时间处均未出现色谱峰(见图4)。

3.3 方法学考察

3.3.1 线性关系考察 精密吸取3.1.1项下的混合对照品溶液3、9、15、20、25 μL，注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为：金丝桃苷Y=69.528X-0.881 8(r=0.999 7)；槲皮苷Y=57.908X-4.314(r=0.999 8)。结果表明，金丝桃苷和槲皮苷分别在0.102 6～0.855 0、0.085 8～0.715 0 μg呈良好的线性关系。

注：A.混合对照品；B.枇杷叶供试品；C.空白溶液；1.金丝桃苷；2.槲皮苷。图4 枇杷叶及对照品的HPLC图

3.3.2 精密度试验 取3.1.1项下对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，每次进样20 μL，记录峰面积。结果金丝桃苷和槲皮苷峰面积的RSD分别为1.40%、1.28%，表明该仪器精密度良好。

3.3.3 稳定性试验 取2.2.2项下供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别在0、4、8、12、18、24 h进样20 μL，记录峰面积，结果金丝桃苷和槲皮苷峰面积的RSD分别为0.58%、1.08%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.3.4 重复性试验 按2.2.2项下供试品溶液制备方法平行处理同一批次(批号170101)样品6份，按2.1项下色谱条件分别测定，每次进样20 μL，记录峰面积。结果金丝桃苷和槲皮苷含量的RSD分别为2.16%、2.43%，表明该方法重复性良好。

3.3.5 加样回收率试验 取已知含量的同一批枇杷叶(批号170101)粗粉1.0 g，共6份，分别加入与样品中待测成分含有量相当的对照品溶液，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样20 μL，记录峰面积，计算平均加样回收率。金丝桃苷和槲皮苷平均加样回收率分别为99.76%、95.56%，RSD分别为4.88%、4.84%，结果表明该方法的回收率良好。

3.4 样品测定

取不同批次及不同生长阶段的枇杷叶药材适量，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下进行测定，平行测定3次，记录峰面积，测定结果见表1～2。

表1 不同批次样品测定结果 mg·g-1

表2 不同生长阶段的枇杷叶测定结果 mg·g-1

由表1～2发现，枇杷叶中两种黄酮类化合物的含量有一定的差异，说明其黄酮类成分因枇杷叶的生长环境、采集季节等而有所不同，其在不同生长阶段的分布规律有待进一步研究。

4 讨论

4.1 供试品处理方法的选择

样品在前处理过程中考察了加热回流提取、超声提取法及石油醚脱脂法[7-9]，结果回流提取法使有效成分提取较完全，先后考察了乙醇的体积分数、用量、回流时间和回流次数的影响，结果方法确定为70%乙醇50 mL回流提取2 h。此外，还考察了柱色谱分离纯化法，比较了大孔吸附树脂D101型及MCI GEL CHP 20柱，因MCI GEL CHP 20柱洗去糖和其他水溶性成分，脱叶绿素效果好，且对皂苷类和黄酮类成分分离、纯化效果较好。

4.2 流动相系统的选择

为保证金丝桃苷和槲皮苷含量测定的准确性，减少误差，试验中分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液的流动相体系，结果表明，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，基线波动较大，峰形不理想，而以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相可以看出谱图中特征峰出峰时间适宜，且峰形较好，分离度好，基线漂移小，因此选择乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相系统。