乳腺癌术后组织cox-2表达与其微血管生成及预后的关系

赵晓燕 谢 竞 付 倩 张 兰 霍彦平

乳腺癌是发生在女性乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，其发病机制复杂，无明显表现症状，且随着病情的发展进一步出现淋巴转移等恶化症状，导致预后效果不佳，严重影响患者的健康生活[1]。目前，临床可通过外科手术给予肿瘤组织切除，可有效控制肿瘤发展，改善患者病情，但仍有部分患者因病情恶化而出现复发转移，其机制可能与肿瘤的血管生成有关[2]。有研究显示，环氧合酶2(cox-2)是1种诱导基因，与肿瘤的发生发展密切相关，但有关cox-2与肿瘤的血管关系还有待进一步深入研究[3-4]。对此，本研究通过给予检测乳腺癌术后组织cox-2表达，探讨其与微血管生成及预后的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年3月至2017年3月本院乳腺癌术后组织及其癌旁正常乳腺组织各160例，纳入标准：①经临床症状、实验室、影像学等检查证实为乳腺癌术后[5]，②就诊前1个月无免疫、放化疗、抗感染等治疗史，③无精神病病史，④签署知情同意书；排除标准：①妊娠及哺乳特殊人群，②血液性疾病，③有心、肝、肾等严重性疾病，④拒绝或终止本次研究者。其中年龄26～72岁，平均年龄(48.21±20.57)岁，体质量指数(BMI)(19.06～30.40)kg/m2，平均BMI (24.21±4.06)kg/m2，临床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期51例，Ⅲ期38例，Ⅳ期32例，癌症类型：导管癌61例，小叶癌58例，腺癌伴粉刺样癌41例，本次研究已经我院伦理委员会审批且通过，所有数据来源真实可靠。

1.2 方法

所有患者经乳腺癌手术切除3 d后，利用常规手术切除乳腺癌术后组织及其癌旁正常乳腺组织作为新鲜标本，采用免疫组化SP法检测组织中cox-2、微血管密度(MVD)表达；所有标本经10%甲醛固定和石蜡，包埋后，连续切片进行脱蜡，切片厚度均为4 μm，同时给予3%H2O2孵育灭活内源性过氧化物酶、封闭非特异性抗原位点等预处理，加入实验鼠抗人cox-2作为一抗，4 ℃孵育过夜，漂洗、复温37 ℃，加生物素标记二抗工作液37 ℃孵育30 min，PBS缓冲液漂洗、DAB显色后用苏木精复染3 min，进行脱水待切片透明后用中性树胶封固，高倍显微镜下镜检，PBS替代一抗作阴性对照。

1.3 指标观察和标准

高倍视野(×400倍)在病灶随机选择5个视野，应使所选视野分布于病灶各部位，cox-2阳性细胞表达及MVD表达为胞质内呈棕黄色颗粒状，主要弥漫性分布于整个细胞胞质。根据SP法染色以细胞质中出现变异性染色的深浅进行评分，阳性强度以无色为0分；淡黄色为1分；黄色为2分；棕黄色为3分。根据组织染色细胞所占总细胞数百分比评分：阳性细胞数<5%为阴性(0分)；5%～25%(1分)；26%～50%(2分)；51%～75%(3分)；>75%(4分)。两者评分相乘，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)，方便试验操作和分析，用(-)代表阴性，(+)(++)(+++)代表阳性，阳性代表高表达[5]。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 乳腺癌术后组织及癌旁正常组织中cox-2、MVD表达比较

乳腺癌组织cox-2、MVD表达明显高于正常乳腺组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 乳腺癌术后组织及癌旁正常组织的cox-2、MVD表达比较

2.2 乳腺癌术后组织cox-2表达与其微血管生成及预后关系的单因素分析

单因素分析结果显示，cox-2表达与MVD表达、临床分期、淋巴结转移、远处转移、病理分级等有关(P<0.05)，见表2。

2.3 有无cox-2表达患者的生存预后比较

cox-2表达患者1年无进展生存率70.63%(113/160)，明显低于无cox-2表达患者的90.63%(145/160)，差异有统计学意义(χ2=20.485，P<0.05)，见图1。

3 讨论

乳腺癌是女性三大恶性肿瘤之一，随着近年来生活节奏的加快和医学知识的匮乏导致该发病率有明显上升的趋势，已成为当前社会的重大公共卫生问题。目前，乳腺癌通过手术切除术可有效切除肿瘤组织，控制癌细胞扩散，但仍有部分患者的病情复发转移，故如何针对性确保患者术后预后转归具有重要的临床意义[6-7]。

有研究显示，乳腺癌是1种典型的血管依赖性病变，乳腺癌的发生与血管的生成密切相关，其机制可能肿瘤的存在打破血管生成促进因子上调和血管生成抑制因子下调的平衡，继而使血管异常增生[8]。其中MVD是特定肿瘤区域的微血管计数，是临床上肿瘤侵袭转移潜能的预测指标[9]。同时也有研究显示，cox-2是催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质过程中的一个关键限速酶，其应答基因迅速，当细胞受到刺激后开始合成；同时具有促进新生血管生成的作用，增加肿瘤细胞的侵袭性，其高度表达可提高肿瘤发生及转移的潜能及增加肿瘤细胞的浸袭力[10]。

对此，本研究通过采用免疫组化SP法检测组织中cox-2、MVD表达，结果发现乳腺癌组织cox-2、MVD表达明显高于正常乳腺组织，而郑玲玲等[11]的研究中也提示乳腺癌的发展与新生血管有关，进一步提示乳腺癌的发生发展与cox-2、MVD表达密切相关。这可能由于机体遭受肿瘤侵袭时，癌细胞会破坏血管的正常生成机制，从而使血管内皮细胞增殖，诱导肿瘤血管生成，继而使MVD、cox-2高度表达。同时单因素分析结果显示，cox-2表达与MVD表达、临床分期、淋巴结转移、远处转移、病理分级等有关，表明cox-2的表达受多种因素的影响。这有可能由于MVD的计数越高，提示机体的肿瘤新生血管增多，而cox-2则是新生血管生成的重要因素之一，故随着肿瘤新生血管的增多，其表达越高，而姚红等[12]的研究提示癌组织的发生发展与cox-2、MVD协同变化有关，为上述结论提供了重要的依据。而临床分期越高的患者表明其病情越发严重，癌细胞快速生长且向外扩散，导致细胞质内产生缺氧环境而增加缺氧诱导因子α的合成，进一步影响肿瘤血管的生成。同时患者发生淋巴结转移则意味着肿瘤的发育可能进入晚期，肿瘤细胞侵入血管，通过静脉与淋巴管吻合处进入淋巴管，从而诱导新生淋巴管的形成，使cox-2高度表达。而肿瘤发生远处转移则提示肿瘤细胞具备向正常细胞侵袭的能力，且已新生肿瘤血管，继而导致肿瘤增大发生转移，从而使cox-2快速合成；而肿瘤的病理分级程度越高，其恶化程度越严重，继而加剧肿瘤细胞发生转移，肿瘤血管的大量异常增生[13-14]。从上述因素分析得出cox-2的高度表达与肿瘤的病情严重程度密切相关。此外，cox-2表达患者1年无进展生存率明显低于无cox-2表达患者，表明cox-2的表达可作为乳腺癌患者的预后生存指标，这有可能由于cox-2的高度表达会加剧肿瘤细胞的增殖与分化，抑制肿瘤细胞凋亡，提高肿瘤血管的生成，加剧肿瘤发生转移，而李鸿涛等[15]的研究结论也明确cox-2是乳腺癌组织中的预后重要因素之一，进一步提示医师应定期检测乳腺癌术后患者的cox-2表达，把控患者的病情发展，同时应制定对cox-2表达的患者的相关治疗方案，提高患者的预后生存。

表2 乳腺癌术后组织cox-2表达与其微血管生成及预后关系的单因素分析(例，%)

图1 有无cox-2表达患者的生存曲线

本研究仍存在一定不足，如样本量较少不足以代表所有案例，但乳腺癌术后组织cox-2表达与其微血管生成及预后有关，有望成为乳腺癌抗血管形成治疗的重要生物靶点，同时检测cox-2表达对评估患者微血管生成及预后具有重要的价值。