自噬在胰腺癌及其治疗中作用的研究进展

张 超， 王伟艺 综述 唐文皓 审校

（复旦大学附属华东医院普外科，上海 200040）

中国国家癌症中心2018年统计数据显示，胰腺癌发病率虽然列中国城市男性恶性肿瘤第8位，但死亡率居第5位［1-2］，5 年生存率为 2%～9%［3］。 胰腺癌之所以成为致命的恶性肿瘤之一，是因为其发现困难且易转移。临床上晚期病人多见，治疗手段有限，且胰腺癌对大多数化疗方案有高耐药性［4］。因此，研究胰腺癌发生、发展的生物学特性和机制，并寻找新的治疗方法成为当前的热点，而自噬是贯穿胰腺癌发生、发展的重要机制，也是胰腺癌耐药的原因之一［5］。本文就自噬与胰腺癌之间的关系及自噬在胰腺癌放、化疗中作用的研究进展作一综述，并讨论自噬作为胰腺癌治疗新靶点所面临的问题及可能的解决方案。

自噬的定义及功能

巨自噬(简称自噬)是细胞降解损伤的蛋白质及细胞器的生理过程。自噬可在细胞受到饥饿、高温、低氧及激素等刺激，或细胞器损坏、突变蛋白质积聚及微生物侵袭等应激时发生，以此维持细胞内稳态并提高细胞生存能力，同时也是一种细胞死亡机制。

自噬有以下几个功能［6-7］。①降解作用：去除损伤的生物大分子及细胞器，维持细胞稳态，帮助细胞重构。降解的同时为细胞提供能量，提高细胞在恶劣环境的生存能力。降解的产物为合成葡萄糖、氨基酸及新的细胞器等提供物质基础。②运输作用：自噬可作为从细胞质到溶酶体或液泡的通路。自噬也用于主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子提呈内源性抗原。③诱导细胞死亡：过度激活细胞自噬可导致细胞程序性死亡，即Ⅱ型程序性死亡，是除凋亡外的另一种程序性细胞死亡通路。

自噬与胰腺癌

一、自噬与胰腺癌的发生、发展

胰腺癌的发生是多个基因突变累积的结果。Yang等［8］发现，在肿瘤启动突变(Kras突变和Trp53缺失)的背景下，抑制小鼠自噬更易发生胰腺腺泡导管化生和癌前病变——胰腺上皮内瘤变 (pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN)，尚未癌变的细胞可能通过自噬清除作用减少DNA的损伤来维持细胞稳定。但自噬缺失引起的胰腺癌前病变向浸润性癌进展的能力受损［9］，说明胰腺癌细胞形成后又需要通过自噬促进自身发展。

在肿瘤形成后细胞自噬被高度激活，是胰腺癌在体外和体内持续生长所必需的［10］。 Yang 等［8］观察到胰腺癌细胞系中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Atg7的表达显著升高。电子显微镜观察也发现胰腺癌细胞中自噬体与溶酶体的融合过程。在异种移植和原位移植小鼠模型中观察到，使用自噬抑制剂氯喹(CQ)治疗可使Kras驱动的胰腺癌基因工程小鼠的存活率显著提高。作者认为自噬水平提高是一种后天改变，并指出自噬通过阻止活性氧 (reactive oxygen species,ROS)毒性的积累，并提供物质维持氧化磷酸化来促进胰腺癌生长。

胰腺癌是一种高度纤维化、乏血供和结缔组织过度增生的恶性肿瘤，其特征之一是间质细胞充斥。间质细胞自噬也促进了胰腺癌的发展。

胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell,PSC)是与胰腺癌细胞相互作用的主要基质细胞［11］。PSC可分泌细胞外基质分子和细胞因子。如白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)，增强肿瘤的侵袭性，与胰腺癌病人生存时间负相关，与疾病复发正相关。但PSC需从静止状态转变为激活的肌成纤维细胞样细胞才能发挥作用［11］。 Endo 等［12］发现，PSC 的激活与自噬相关。其认为是肿瘤微环境、胰腺癌细胞分泌的生长因子甚至PSC自分泌的IL-6因子参与促进PSC的自噬。抑制PSC自噬可通过改变肿瘤间质来降低胰腺癌侵袭性，但未降低其增殖性。Sousa等［13］的研究也证实PSC和肿瘤细胞在胰腺癌中的交叉作用。其中PSC需自噬来分泌丙氨酸，而肿瘤细胞吸收丙氨酸以支持其生长。Yang等［8］利用可调控细胞自噬相关基因(ATG4B)表达水平的小鼠模型，比较PSC和胰腺癌细胞自噬对肿瘤生长的相对贡献，证实间质细胞自噬在肿瘤转移植入中起主要作用，而在肿瘤细胞增殖中起次要作用。另有研究发现PSC可分泌一种胞外基质蛋白Lumican，后者可抑制癌细胞复制。其在早期抑制胰腺癌的生长［14］，在晚期胰腺癌中可增强其侵袭性［15］。 Li等［16］的研究表明，缺氧诱导PSC自噬。进而降解和降低PSC内蛋白质合成，使胰腺癌基质中的Lumican减少，说明胰腺癌间质细胞的自噬有助于胰腺癌早期的生存发展。但作者并未具体解释其对晚期胰腺癌的影响。

成纤维细胞亦是胰腺癌微环境的重要组成部分［17］。肿瘤自噬间质模型的研究发现，胰腺癌细胞在癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblast,CAF)和其他基质细胞中诱导氧化应激，导致ROS过量产生［18-19］。过量的ROS生成会促使邻近癌细胞产生抗氧化防御，保护其不被诱导凋亡。此外，过量的ROS具有旁观者效应，使相邻癌细胞中的DNA损伤，并呈现非整倍性DNA，两者都是基因组不稳定的标志。最后，ROS诱导的氧化应激在肿瘤微环境中诱导自噬和线粒体自噬，导致含有营养物质(如酮和L-乳酸)的基质过量产生。这些可循环利用的营养物质或化学物质可促进癌细胞产生线粒体，从而促进癌细胞的合成代谢。较多的线粒体可维持肿瘤细胞的高代谢需求。该研究还表明，酮和乳酸有助于促进肿瘤生长和癌细胞转移，并作为癌细胞的化学引诱剂。这与 Guo 等［20］的研究一致 。Zhang 等［21］胰腺癌细胞与CAF的研究指出，CAF对癌细胞的增殖无明显的刺激作用，但阻断CAF自噬可抑制癌细胞增殖，并提高胰腺癌细胞对化疗的敏感性。

胰腺癌微环境中间质细胞被外界刺激或胰腺癌细胞影响诱导了自噬，并通过自噬产生细胞外基质、细胞因子、营养物质等，增强胰腺癌的侵袭性，也维持胰腺癌的增殖。间质细胞提供源源不断的代谢物，也解释了胰腺癌作为乏血供肿瘤的能量来源。

胰腺癌周围组织中的自噬水平影响预后。Fujii等［22］在胰腺癌病人化疗前的癌组织中，通过LC3免疫组织化学检测观察到自噬，并发现胰腺癌周围组织强烈的LC3信号与病人预后不良呈正相关，提示这些区域中自噬的存在可能与癌症进展有关。因此，提出胰腺癌自噬的临床病理学意义，胰腺癌癌周组织LC3水平的高表达与预后差和无瘤生存期短高度相关。Yang等［10］也发现，胰腺癌转移的淋巴结以及被浸润的神经纤维中有高强度LC3染色。这些研究提示异常的自噬参与胰腺癌的发生、发展过程，甚至肿瘤的转移，并可能影响胰腺癌的预后。

自噬对胰腺癌的增殖和侵袭有重要作用，且不局限于胰腺癌细胞。间质细胞、胰腺癌周围组织、远处淋巴结及神经纤维等都有自噬作用的参与。这表明自噬贯穿了胰腺癌的发生、发展，在胰腺癌中普遍存在，并起着关键作用。

二、自噬对胰腺癌的作用与肿瘤基因图谱有关

胰腺癌的发生是多个突变累积的结果，涉及12条核心通路的改变［23］，但其基因突变序列几乎恒定［24-25］。 其中 Kras基因的功能增益突变是第一个被观察到的遗传改变，95%以上的胰腺癌存在Kras突变。因此，Kras突变被认为是胰腺癌的起始基因病变。此外，约75%的p53突变和55%的SMAD4缺失发生在胰腺癌发展后期［24-26］，通常为杂合性突 变［27］。

许多研究都证明自噬的促进作用。但最近有学者发现自噬在某些情况下表现为抑癌作用。Rosenfeldt等［28］发现小鼠胰腺细胞Kras突变可使小鼠出现PanIN，并向胰腺癌发展。然而当敲除自噬相关基因Atg7或Atg5时，转化限于PanIN-1和少量PanIN-2，形成PanIN-3和胰腺癌的过程受阻，表明Kras突变驱动的胰腺癌需自噬的参与。但Rosenfeldt等［28］发现小鼠胰腺细胞在Kras突变同时缺失p53的情况下，自噬的缺失并不会阻碍胰腺癌的发展，甚至加速疾病的发生。另外，使用自噬抑制剂羟氯喹治疗小鼠，可显著加快肿瘤形成。即在Kras驱动的胰腺癌中，p53正常时自噬促进肿瘤发生、发展，p53突变或缺失时自噬抑制肿瘤发展。PTEN是另一种抑癌基因，在胰腺癌中突变概率较低。Rosenfeldt等［29］的进一步研究发现，在PTEN基因缺失的动物中，自噬缺失(Atg7缺失)也未阻碍Kras驱动的胰腺肿瘤形成。且与自噬能力强的动物相比，自噬缺失更易因胰腺癌的形成而出现早期死亡。即PTEN的缺失与否，决定自噬对Kras驱动的胰腺癌是抑制作用还是促进作用。Rosenfeldt等［29］提出，自噬对肿瘤发展的作用由PTEN、p53或其他未知因素的状态来决定，并对使用自噬抑制剂治疗胰腺癌提出质疑。

考虑到Rosenfeldt等使用的是p53纯合性缺失模型，而胰腺癌多为杂合性缺失［27］，Yang 等［9］培养了 3 种不同 p53 基因型(p53+/-、p53-/-和p53R172H/+)的小鼠胰腺癌细胞系。通过敲除Atg5或采用氯喹抑制自噬时，这3种细胞系的增殖均受到抑制。即无论p53是否发生突变或缺失，抑制自噬对肿瘤的生长均起到抑制作用。且羟氯喹还可有效抑制小鼠体内人胰腺癌移植瘤的生长。这些移植瘤均为Kras突变伴p53突变。对此作者提出，自噬抑制剂仍是一种值得研究的方法。出现不同结果可能是动物模型不同导致。

自噬与胰腺癌治疗

目前胰腺癌仍以手术治疗为主，术前和(或)术后放、化疗为辅。主要的化疗药物是吉西他滨、氟尿嘧啶类药物，包括卡培他滨、替吉奥以及氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸［5-FU/LV］)［30］。 自噬在胰腺癌的放、化疗中起到不同的作用。

电离辐射可激活胰腺癌细胞自噬，并诱导自噬性死亡［31］。但许多研究发现自噬参与胰腺癌对辐射的抵抗［26,32-33］。其涉及的机制不同。 Wang等［32］发现，MicroRNA-23b表达下降会增加自噬相关蛋白Atg12，进而提高自噬水平。有55%的胰腺癌病人存在 SMAD4 缺失［26］。 Wang 等［26］发现，SMAD4 基因缺陷导致SMAD4蛋白减少，DNA损失修复机制降低，而诱导胰腺癌细胞ROS和自噬水平升高。Wu等［33］发现，lncRNA和HOX transcript antisense RNA(HOTAIR)通过上调Atg7的表达使胰腺癌细胞的自噬水平提高。有研究表明HOTAIR可竞争性结合miR-23b，使miR-23下调［34］。虽然其诱导自噬的机制不同，但增加的自噬都参与胰腺癌对辐射的抵抗。

许多一线的胰腺癌治疗方案都涉及自噬相关细胞死亡，即Ⅱ型程序性死亡［6-7］。 Mukubou 等［31］研究表明，吉西他滨、红外线电离辐射对胰腺癌细胞作用后，可激活其自噬，并诱导自噬作用来抑制癌症。研究显示吉西他滨和红外线处理诱导自噬有协同作用，且自噬水平越高，细胞凋亡比例越高。并且，加入自噬抑制剂后，需更大剂量的吉西他滨才能取得与原来一样的杀伤效果，这也表明自噬对胰腺癌细胞有杀伤作用。Pardo等［35］在若干胰腺癌来源的细胞系中也证实吉西他滨治疗诱导VMP1介导的自噬，导致胰腺癌细胞凋亡。大麻素与吉西他滨具有协同作用，通过诱导ROS介导的自噬相关细胞死亡来抑制细胞生长，从而使耐药胰腺癌细胞对吉西他滨敏感［36］。吉西他滨或5-FU可通过联合奥美拉唑增强自噬活性、调节化疗耐受，诱导胰腺癌细胞死亡［37］。

然而也有学者发现，自噬是胰腺癌细胞对化疗药物5-FU的重要耐药机制。通过氯喹或溶酶体光损伤抑制自噬过程可增加对 5-FU 的敏感性［38］。 付志平等［39］的细胞实验则表明吉西他滨诱导的自噬具有保护作用，且抑制自噬可激活凋亡特异性蛋白Caspase-3，引起Caspase依赖的细胞凋亡，从而增加胰腺癌SW1990细胞对吉西他滨的敏感性。这种差别可能与是否联合用药有关。

最近有报道，针对胰腺癌最常见的Kras突变信号通路的靶向药曲美替尼诱导胰腺癌细胞自噬，联合自噬抑制剂后效果优于胰腺癌一线化疗方案。这是由于抑制RAS下游的ERK引起AMPK信号激活和m TORC1信号抑制。这两种信 号 改 变 增 加 了自 噬［40-41］。

研究发现，放疗诱导的自噬有助于保护胰腺癌细胞，使用自噬抑制剂削弱这种保护，可增加胰腺癌放射敏感性。但因为自噬的两面性，联合吉西他滨等以诱导胰腺癌自噬为杀伤机制的化疗药物，可增强胰腺癌自噬，导致胰腺癌细胞自噬相关死亡。临床上放疗必须和化疗联合。放疗期间的同步化疗，常用吉西他滨或氟尿嘧啶类药物［30］。自噬抑制剂的选择应具体情况具体分析。

自噬治疗的悖论及可能的解决方案

自噬对胰腺癌的发生、发展有着极其复杂甚至矛盾的影响。在肿瘤未发生但有危险因素时，自噬有利于细胞稳定，减少异常大分子物质和受损细胞器如线粒体对DNA的损伤，即抑制肿瘤细胞的产生及异质性的形成。在肿瘤早期应用自噬抑制剂将促使胰腺细胞化生及早期肿瘤形成。在肿瘤进展期，因为肿瘤生长不受控制，加上放、化疗的作用，使肿瘤细胞遭受饥饿、缺氧等情况，此时自噬作用将保护癌细胞。这个阶段应用自噬抑制剂将使癌细胞不能利用自噬生存。本阶段肿瘤间质细胞与肿瘤细胞面临着同样的环境，而肿瘤间质细胞的自噬为肿瘤细胞提供了营养物质以及有助于肿瘤转移的微环境。这也是在本阶段应用自噬抑制剂可能有助于增强抗肿瘤药物作用的原因。因此，抑制肿瘤间质细胞自噬可阻止或逆转肿瘤的生长及转移。

自噬在胰腺癌中作用的复杂性归纳为以下几点：①在自然情况下，胰腺癌中自噬的作用是支持胰腺癌细胞生存，促进转移。②在化疗药等治疗措施干预的情况下，由于自噬信号网中的个别通路被加强或抑制或与其他通路串扰，使自噬作用变得复杂，可支持细胞也可杀伤细胞。③诱导自噬是治疗的普遍结果，但有的诱导癌细胞自噬死亡，而有的诱导自噬保护癌细胞。这可能是药物诱导自噬的方式不同所引起，即取决于胰腺癌细胞的自噬是应激还是药物主动诱导的。④微环境对胰腺癌的支持作用来源于自噬增强，即自噬抑制剂可能比自噬激活剂(即主动诱导自噬的化疗药物)应用更广泛。⑤自噬抑制剂可能作为化疗方案的辅料存在，而自噬激活剂则可能是联合应用。因此，需关注几个方面：①自噬抑制剂可能使胰腺化生；②自噬激活剂可能保护胰腺癌细胞；③自噬的作用可能由癌症基因谱决定，不同基因图谱作用可能完全相反。

Yang等［8］最近的研究表明，特异的自噬阻断靶点ATG4B阻断不会加速缺乏癌基因表达的胰腺细胞化生，即不会因为自噬的抑制导致早期肿瘤形成，这一定程度解决了自噬抑制治疗的问题。自噬抑制在肿瘤起始突变 (Kras突变和Trp53缺失)的背景下，可导致上皮化生和癌前病变PanIN。在未表达致癌Kras的胰腺中抑制自噬，未观察到胰腺组织化生。

另外，发现只针对胰腺癌细胞的治疗并不能取得较好的疗效，肿瘤间质在胰腺癌的发生、发展中亦起到重要作用。自噬对肿瘤进展的影响可能表现出明显的环境依赖性。有数据表明，只有在营养丰富和缺乏应激刺激的情况下，依赖自噬的肿瘤才对体内自噬抑制剂有反应［42］。胰腺癌乏血供，多纤维增生，间质CAF是重要的细胞类型。但已有临床试验表明，减少纤维化除一线方案外并不利于病人［43］。因为靶向基质可能导致未分化和侵袭性胰腺癌，这可能是PSC异质性造成的［43］。这表明，减少CAF的治疗并不是一个好选择。更好的选择可能是改变CAF与癌细胞之间相互作用方面。Zhang等［21］提出单纯针对肿瘤间质细胞的自噬抑制剂能有效提高胰腺癌对化疗药物的敏感性。

Sathiyaseelan等［44］提出癌症的自噬抑制策略需考虑环境的补偿机制和(或)自噬的独立效应。并提出，充分理解正常生理和疾病中大量的自噬、线粒体自噬和其他形式选择性自噬调节剂是实施更精细乃至个性化自噬调节策略的基础。

复杂性和展望

综上所述，对细胞而言，自噬反应几乎总是有益的，但当其发生在已开始恶性转化的细胞中时，对宿主是有害的。最初，胰腺细胞因某些原因导致自噬缺陷，使健康的细胞获得恶性特征。之后，一旦恶性肿瘤形成，在不利的微环境条件下，有效的自噬反应得以恢复并可能对支持癌细胞的增殖和生长至关重要。可见自噬水平在胰腺癌发生、发展的各过程产生不同的变化并起到不同的作用。

基于自噬对胰腺癌发生、发展的复杂影响及外界干预的机制不同，自噬在胰腺癌治疗中亦起着复杂的作用。笔者提出一些建议：①由于基因图谱可能影响自噬的作用，临床上使用自噬抑制剂前可取活检或标本明确胰腺癌细胞对自噬的实际依赖性。②对于抑制自噬可促进胰腺细胞化生这一可能的不良反应，研究发现肿瘤开始突变的情况下自噬抑制才有促进作用，且特异的自噬阻断靶点ATG4B阻断被证明不会促进缺乏癌基因表达的胰腺细胞化生［8］。间断使用自噬抑制剂可在起到相同疗效的同时减少对正常组织的作用［8］。③设计药物使其不能通过血脑屏障，可降低药物的神经毒性。④抑制胰腺癌间质细胞的自噬，既可抑制癌细胞生长，又可抑制转移。⑤使用自噬抑制剂前应明确药物的作用机制，若药物杀伤机制主要是诱导自噬死亡，应避免使用自噬抑制剂。总之，探索特异自噬抑制剂，并阐明其与其他抗肿瘤药物在胰腺癌中的相互作用机制，将为胰腺癌的临床治疗提供新的方法及思路。