酞菁光敏剂抗小鼠宫颈癌的光动力学实验

杨永帅，贾玉华，蔡良知，徐 芃，戴 涛，陈锦灿，胡 萍,，黄明东，陈 卓

(1.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002；2.中国科学院福建物质结构研究所结构化学国家重点实验室，福建 福州 350002；3.福建省妇幼保健院妇科，福建 福州 350001；4.福州大学化学学院，福建 福州 350108)

0 引言

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，在女性恶性肿瘤疾病中位居前列[1].2018年全球癌症统计数据显示,我国宫颈癌的发病率逐年上升，且表现出年轻化趋势[2].传统的肿瘤治疗手段(手术、放疗和化疗)往往给患者的机体和精神带来极大痛苦和伤害，而且长期的放化疗容易使肿瘤细胞产生耐药性，导致复发[3-4].因此，寻找新的有效抗肿瘤疗法迫在眉睫.

光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是通过特定波长的光照射肿瘤部位，使蓄积在肿瘤部位的光敏剂被激发，产生单线态氧或自由基，从而破坏周围的肿瘤细胞[5]、影响基因表达[6]、抑制肿瘤微血管生成[7].该疗法具有毒副作用小[8]、不产生耐药性、创伤面积小[9-10]等优点.在众多的光敏剂中，酞菁类光敏剂理化性质稳定，在长波段(670～850 nm)有强吸收，与卟啉类光敏剂相比，表现出较强的光动力学特性和较低的皮肤光毒性[11]，是具有潜在前景的新一代抗肿瘤光敏剂.近年来，随着精准医疗战略的部署，研发具有对肿瘤细胞特异性识别功能的光敏剂备受关注.

本课题组前期通过固相合成法，成功制备了一种高纯度且组分单一的酞菁锌光敏剂五聚赖氨酸-β-羰基酞菁锌.该光敏剂具有良好的生物安全性，同时对多种癌症具有显著抑制作用[12-13].本研究观察该光敏剂在宫颈癌细胞中的摄取及其光动力抗肿瘤作用.构建小鼠宫颈癌模型，比较该光敏剂治疗前后小鼠的肿瘤体积，肿瘤质量以及小鼠体质量等指标变化情况，探索该光敏剂对宫颈癌的治疗作用，为光动力疗法用于宫颈癌临床治疗提供重要理论依据.

1 材料和方法

1.1 实验仪器

P230P高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)；分析柱SinoChrom ODS-BP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)(大连依利特分析仪器有限公司)；MAXI-DRY LYO 真空浓缩冻干机(丹麦 Heto-Holten公司)；5810R高速离心机(美国 Eppendorf 公司)；ZHJH-C1115B垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；LED 平板光源(香港 Uniglory Electronices公司)；BB15 CO2细胞培养箱(美国 Thermo Fisher Scientific公司)；XSP-37XB倒置生物显微镜(上海光学仪器厂)；GI100TR灭菌器(美国 ZEAL WAY公司)；LC-122A 670 nm激光器(660 mW)(美国 Luma Care Medical Group公司)；Synergy 4 多功能酶标仪(美国 BioTek公司).

1.2 动物、细胞及细胞培养条件

动物：雌性SPF级BALB/c近交系小鼠(6～8周龄)，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号为SCXK(沪)2017-0005，合格证号为2015000547947.实验小鼠饲养于12 h光照/12 h黑暗的SPF级环境中，自由摄食和饮水.动物适应1周后进行实验.

肿瘤细胞株：人宫颈癌细胞Hela(购于中国科学院上海生科院细胞资源中心).

肿瘤细胞培养基：DMEM高糖培养基(含1%(体积分数，下同)链霉素、1%青霉素、10%胎牛血清).

肿瘤细胞培养条件：37 ℃、5%(体积分数)CO2培养.

1.3 光敏剂的制备

光敏剂中间体单羧基酞菁锌(ZnPc-COOH)的合成：根据本课题组前期工作[14]，将尿素、邻苯二甲酸酐、无水醋酸锌、偏苯三甲酸酐充分研磨后，与氯化铵、钼酸铵一同置于带有搅拌子和回流装置的三颈烧瓶中，油浴加热至170 ℃，反应4 h，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解样品，将反应液倒入冰水中，沉淀析出后，进行抽滤并烘干，取1 mol·L-1氢氧化钾溶液100 mL加入所得的固体，油浴搅拌加热至80 ℃并反应24 h，然后先用0.5 mol·L-1盐酸洗涤，之后水洗至中性，柱层析分离即得ZnPc-COOH.该化合物的摩尔消光系数ε=120 000 L(mol·cm)-1，根据Lamber-Beer定律A=C×L×ε，借助Synergy4多功能酶标仪检测其最大吸收波长处的吸光度值，可获得所配制溶液的浓度.

光敏剂五聚赖氨酸-β-羰基酞菁锌(ZnPc-(Lys)5)的制备：该光敏剂的合成方法比较成熟[12,15]，即取上述已合成的中间体ZnPc-COOH适量，与活化剂N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-羟基苯丙三唑(HOBt)溶于含有5%(体积分数，以下同)吡啶的DMF中，活化30 min后与五聚赖氨酸树脂加热超声，用DMF洗涤至无色后冷冻干燥，并与95%的三氟乙酸(TFA)混合反应4 h.过滤反应液后冷冻干燥，将所得固体溶解于甲醇并离心取上清液，冷冻抽干即得粗品.进一步的纯化方法：称取0.6 g ZnPc-(Lys)5粗品，加入12 mL甲醇溶解，室温12 000 r·min-1离心2 min，将上清液经过高效液相分析仪，梯度洗脱法(有机相洗脱剂为含0.1% TFA的CH3OH∶CH3CN为1∶1(体积比)的混合液，水相洗脱剂为含0.1% TFA的纯水；洗脱程序为有机相在25 min内体积分数从10%增加到100%)分析，收集特定峰区间的溶液后，旋蒸、冷冻干燥，所得产物即为纯化后的ZnPc-(Lys)5.该化合物的摩尔消光系数为ε=118 380 L(mol·cm)-1，根据Lamber-Beer定律，利用Synergy4多功能酶标仪检测其在最大吸收波长处的吸光度值，即可获得所配制溶液的浓度.

1.4 宫颈癌细胞Hela对光敏剂的摄取

将生长状态良好的宫颈癌细胞Hela接种在96孔板(每孔约4×104个细胞)后，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养12 h，待细胞贴壁后，分别加入10 μmol·L-1的光敏剂(ZnPc-(Lys)5或ZnPc-COOH),并检测经过不同孵育时间点(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 h)的摄取情况.具体做法是：光敏剂与细胞经过不同时间的孵育后，先用磷酸盐缓冲液(PBS)洗去未结合的药物，然后在各孔中加入100 μL细胞裂解液(由0.1 mol·L-1NaOH、体积分数为1%的SDS以及1%的DMSO组成)，常温静置2 h后，借助Synergy4多功能酶标仪检测680 nm荧光值(610 nm激发).与此同时，利用不同浓度的光敏剂制备相应的荧光标准曲线，然后根据该标准曲线判断细胞经过不同孵育时间对光敏剂的摄取总量.此外，根据BCA检测法检测各孔总蛋白含量，并最终计算得到各组细胞对光敏剂的摄取情况.

1.5 光敏剂对体外宫颈癌细胞Hela的光动力作用

将生长状态良好的宫颈癌细胞Hela接种在96孔板(每孔约104个细胞)，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养12 h，待细胞贴壁后，除对照组，其余各给药组分别加入不同浓度光敏剂(终浓度分别为3.000 0、1.000 0、0.300 0、0.100 0、0.030 0、0.010 0、0.003 0、0.001 0、0.000 3 μmol·L-1)，并孵育4 h后更新培养液，经过光照处理(670 nm激光照射37 s，光剂量为1.5 J·cm-2)后，利用四唑盐(MTT)法检测细胞的存活和生长情况.实验重复3次，每次设置对照组和给药组，每组有4个复孔.与此同时，进行相关光敏剂的暗毒性实验，不进行光照处理，直接用MTT法检测细胞的存活和生长情况.

1.6 光敏剂对Hela荷瘤小鼠的光动力作用

取200 μL密度为2×107mL-1的Hela细胞接种于小鼠右背部皮下，建立Hela荷瘤小鼠模型.待小鼠肿瘤体积约80 mm3后随机分成4组，每组8只小鼠，分别为对照组(尾静脉注射200 μL，体积分数为0.9%的生理盐水)和给药组(分别尾静脉注射200 μL的0.3 μmol·L-1ZnPc-COOH、0.3 μmol·L-1ZnPc-(Lys)5或1.0 μmol·L-1ZnPc-(Lys)5).给药4 h后，对肿瘤部位进行光照(670 nm激光照射3 min，光剂量为30 J·cm-2)，并每天记录小鼠体重及肿瘤体积(V=a×b2/2，其中a为肿瘤的最长径，b为肿瘤的最短径)，最后绘制其体重和肿瘤体积的变化曲线.实验结束后，对各组荷瘤小鼠的瘤体进行称量并记录.

1.7 数据分析

所有实验至少重复3次，所有数据表示为平均值和标准误(SEM).细胞对光敏剂的摄取、光敏剂对细胞的光毒性和暗毒性、光敏剂对荷瘤小鼠的光动力作用等实验数据均采用双因素方差分析.95%置信水平,*P<0.05表示差异具有统计学意义，**P<0.01表示差异极具有统计学意义.数据处理软件包括Graph Pad Prism、Chem Bio Draw和Microsoft Excel 2013.

2 结果与分析

2.1 光敏剂的紫外-可见吸收谱图

光敏剂的化学结构式如图1所示，其紫外-可见吸收谱如图2所示.

图1 光敏剂的化学结构式Fig.1 Chemical structure formulas of photosensitizers and their UV-Vis absorption spectrum

酞菁光敏剂 ZnPc-(Lys)5最大吸收峰(680 nm)与其中间体ZnPc-COOH最大吸收峰(676 nm)比较接近.相比之下，ZnPc-(Lys)5出现最大吸收峰红移可能是由于其偶合的五聚赖氨酸在其支链上的助色基团-NH2增加所致.

2.2 宫颈癌细胞对光敏剂的摄取

将浓度为10 μmol·L-1的不同光敏剂与宫颈癌细胞Hela共同孵育，并在不同时间点检测Hela细胞对光敏剂的摄取情况.结果发现随着光敏剂与Hela细胞孵育时间延长，它们被Hela细胞摄取的量逐渐增加，约4 h后接近饱和.相比之下，Hela细胞对ZnPc-(Lys)5的摄取明显高于对ZnPc-COOH的摄取(见图3).出现这种现象的原因可能是肿瘤细胞表面带有较多负电荷，对带较多正电荷的ZnPc-(Lys)5具有更大的吸引力.

图2 光敏剂的紫外-可见吸收谱图Fig.2 UV-Vis absorption spectrum of photosensitizers

图3 宫颈癌细胞Hela对光敏剂的摄取Fig.3 Cellular uptakes of photosensitizers on cervical cancer Hela cells

2.3 光敏剂对宫颈癌细胞的体外光动力作用

将光敏剂与宫颈癌细胞Hela孵育4 h后，观察光敏剂对Hela细胞的光毒性和暗毒性作用.结果显示：在670 nm激光照射、光剂量为1.5 J·cm-2条件下，两种光敏剂对Hela细胞的光动力抗肿瘤效应均为浓度依赖型，即随着光敏剂浓度增加，其光动力抗肿瘤活性逐渐增强(见图4(a)).与ZnPc-COOH的抗宫颈癌作用(IC50为(57.3±5.8)nmol·L-1)相比，ZnPc-(Lys)5抗肿瘤效果稍胜一筹(IC50为(30.5±3.1)nmol·L-1)，约为前者的1.9倍.同时，二者在无光照时并未表现出抗肿瘤活性(见图4(b)).

图4 光敏剂对宫颈癌细胞Hela的光毒性和暗毒性实验Fig.4 Phototoxicity and dark toxicity of photosensitizers on cervical cancer Hela cells

2.4 光敏剂对Hela荷瘤小鼠的光动力作用

为进一步观察光敏剂对在体肿瘤的光动力疗效，本课题组建立小鼠宫颈癌模型，并观察光敏剂对荷瘤小鼠的作用.研究结果显示：对照组小鼠的肿瘤增长较快，而光敏剂各治疗组均对小鼠肿瘤生长产生不同程度的抑制作用(见图5(a)).ZnPc-COOH治疗组(0.3 μmol·L-1)对Hela荷瘤小鼠具有明显抑制肿瘤生长作用，但同样剂量的ZnPc-(Lys)5治疗组，不仅抑制肿瘤生长，而且具有减小肿瘤体积的疗效.当ZnPc-(Lys)5治疗组用药剂量增加为1.0 μmol·L-1时，Hela荷瘤小鼠的肿瘤体积几乎消失，这也验证了该光敏剂的抗肿瘤作用与其浓度正相关.

实验观察11 d后，将不同组小鼠的瘤体称重(见图5(b)).结果显示：在光剂量为30 J·cm-2的光照条件下，同等药物浓度(均为0.3 μmol·L-1)的ZnPc-(Lys)5比ZnPc-COOH具有更显著抗肿瘤作用，而且该抗肿瘤作用随着光敏剂ZnPc-(Lys)5浓度的增加而增强.与对照组(无光敏剂组)相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.

此外，在整个实验过程中，各组小鼠体质量的监测结果(见图5(c))显示：浓度为1.0 μmol·L-1的光敏剂ZnPc-(Lys)5对动物的体重增长没有产生明显影响，这与本课题组之前开展的该光敏剂对其他肿瘤的实验结果相符，提示该光敏剂具有一定的生物安全性.

图5 光敏剂对荷瘤小鼠肿瘤体积、肿瘤质量及小鼠体质量的影响Fig.5 Effects of photosensitizers on tumor volume,tumor weights and body weights in tumor-bearing mice

3 结语

与传统的化疗、放疗等手段相比，光动力疗法作为一种新型的抗肿瘤疗法，具有高效低毒，能减少患者痛苦等优势[9]，受到人们普遍关注.光敏剂作为光动力疗法的主要要素之一，对光动力抗肿瘤疗效至关重要.可以说，光敏剂的光动力活性、光吸收特性及其靶向特性等决定了其临床的适用性[16].

目前备受关注的新一代光敏剂，是在第二代光敏剂的基础上通过偶联上具有生物特性的靶向基团，以提高光敏剂对肿瘤细胞的识别和靶向功能.在目前研究的大多数光敏剂中，酞菁类光敏剂因其具有较高的活性氧(ROS)产率、优良的光物理和光化学特性[17-18]等，优于多数类型的光敏剂而备受关注.但是，酞菁光敏剂存在水溶性差、靶向性有待提高等问题.由于不对称酞菁衍生物存在异构体现象，合成特定的、单一的非对称酞菁衍生物一直是个难题.本课题组前期通过固相合成法，首先合成单羧基取代酞菁锌，并在此基础上通过结合不同的靶向基团—多肽，旨在寻找新型高效的具有靶向性的光敏剂.本研究通过将酞菁光敏剂偶合上带一定正电荷的五聚赖氨酸，即ZnPc-(Lys)5，在提高酞菁光敏剂水溶性的同时，提高对带有大量负电荷的肿瘤的靶向性.

本课题组长期从事酞菁光敏剂领域研究，前期实验研究曾经利用小鼠乳腺癌原位模型，证实了光敏剂ZnPc-(Lys)5对乳腺癌具有良好的抑制作用.本研究主要针对该光敏剂对宫颈癌的治疗作用进行探讨.开展的体外抗肿瘤实验结果表明：带有赖氨酸基团的光敏剂ZnPc-(Lys)5可显著提高其在人宫颈癌细胞Hela中的摄取量，从而增强了其对Hela细胞的光毒性.随后的在体动物实验结果,进一步验证了该光敏剂在浓度仅为0.3 μmol·L-1时，就表现出明显抑制Hela荷瘤小鼠的瘤体生长作用；当药物浓度提高到1.0 μmol·L-1时，Hela荷瘤小鼠的瘤体几乎消失，表现出对荷瘤小鼠极显著的抗宫颈癌作用.综上所述，偶合赖氨酸的光敏剂ZnPc-(Lys)5对宫颈癌治疗具有广阔前景，值得继续开展下一步的研发.