MAPK信号通路与HBV感染相关性HCC的研究进展

杨晓娟， 朱博兰， 张 裕， 卢利霞， 惠 玲， 于晓辉， 任小龙

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院消化科；3.甘肃省干细胞与基因药物重点实验室

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见恶性肿瘤之一，近26年HCC的全球发病率增加了114%，其中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒和酒精是HCC的主要诱因。其中，HBV所致的HCC年估计百分比变化为0.22(95%CI：0.08～0.36)，提示HBV感染是HCC发生、发展的主要诱因[1]。HBV主要由核酸和衣壳组成，当其进入宿主细胞后在胞质内脱下衣壳蛋白，核酸则继续进入宿主细胞核并发生整合。HBV基因组的核心是4个开放的阅读框S区、C区、P区和 X区。其中，C区是HBV发生基因突变的主要区域；P区可编码多种功能性蛋白参与HBV 的复制；S区是表达HBV抗原进而被宿主识别的主要部位；X区编码乙肝病毒X蛋白(HBX)激活病毒或通过调控其他蛋白质促进HBV感染相关性HCC的发生。研究发现，HBV直接感染宿主肝细胞与其基因序列发生整合[2]，进而迅速募集免疫细胞及具有免疫能力的细胞并产生各种细胞因子，共同参与HCC的形成[3]。在此过程中，信号通路的异常活化起到了重要作用。现有大量研究提示，MAPK信号通路在HBV感染相关性HCC的发生中扮演了重要角色[4]，现对MAPK信号通路与HBV感染相关性HCC的研究进展作一概述。

1 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路的概述

MAPK家族，是一类由丝/苏氨酸蛋白激酶组成的蛋白激酶系统。它包括细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(cJun-N-terminal kinase，JNKs)、p38MAPK和ERK5[5]。当MAPK被级联激活，可以调节细胞增殖、分化和凋亡等过程，进而调控细胞生长状态。许多实验研究表明，ERK1/2[6]、JNKs[7]和p38MAPK[8]在HBV感染相关性HCC发生中均发挥重要作用。ZAMANI等[9]通过比较高致瘤性Huh-7.4细胞与非致瘤性Huh-7.5细胞的蛋白质组谱时，发现ERK5与 HCC的发生密切相关。但关于ERK5是如何影响HBV感染相关性HCC发生、发展的目前尚无研究报道。由此可以得出，MAPK信号通路的异常激活在HBV感染相关性HCC的进程中发挥着举足轻重的作用。

2 ERK1/2信号通路与HBV感染相关性HCC

目前，已知的ERK共有7种，其中与HBV感染相关性HCC关系最密切的是ERK1和ERK2。ERK1和ERK2是由相同基因编码的蛋白质，具有共同的底物，协同发挥作用。生长因子、生长因子受体结合蛋白和细胞外基质等是ERK1/2信号通路常见的始动因素，通过启动ERK1/2信号级联反应，进而影响细胞的侵袭与迁移。多梳蛋白SUZ12是一种与HCC转录密切相关的蛋白质，XUE等[10]发现，它可以通过ERK1/2信号通路影响HBV感染相关性HCC的形成。利用siRNA沉默HBV阳性的Hep3B肝癌细胞中 SUZ12，发现P-ERK1/2、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和MMP-2的表达均上调，促进HCC细胞的增殖、侵袭和迁移。提示SUZ12可能是通过ERK1/2信号通路影响HCC侵袭和迁移的。为了进一步验证ERK1/2信号通路在HBV感染相关性HCC中的作用，向上述细胞中加入ERK1/2特异性抑制剂SCH772984，发现MMP-9和MMP-2的水平较前下调，这提示ERK1/2信号通路可能是通过调节MMP-9和MMP-2的表达进而影响HBV感染相关性HCC的侵袭和迁移，说明ERK1/2信号通路与HBV感染相关性HCC的发生、发展密切相关。但HBV作为一个病毒，是如何通过ERK1/2信号通路促进HBV感染相关性HCC的发展，仍需进一步说明。

前面提到，HBV表达的HBX蛋白可以调控其他蛋白质的磷酸化水平，进而活化某些信号通路。由此推测，HBV可能是通过上调HBX蛋白的表达从而激活ERK1/2信号通路，促进HBV感染相关性HCC的进展。有研究报道[11],在过表达HBX的HepG2肝癌细胞中，发现HBX可以上调长链非编码RNA lncIHS的水平、p-MEK1/2、p-ERK1/2、c-Myc和Cyclin D1的表达，提示HBX蛋白可能是通过ERK1/2信号通路促进肝癌细胞增殖、侵袭和迁移。随后，利用MEK1/2抑制剂U0126处理上述肝癌细胞，发现随着ERK1/2信号通路被抑制，c-Myc、Cyclin D1和HBX蛋白[6]等的磷酸化水平降低，肝癌细胞发生的增殖、侵袭和迁移在一定程度上被逆转，HBV的复制也明显减慢。由此可知，ERK1/2信号通路可以上调调控c-Myc、Cyclin D1和HBX蛋白等的磷酸化水平，促进HBV感染相关性HCC的发展。前面提到HBV感染相关性HCC的发生与HBV感染、宿主免疫系统异常均密切相关。因此，我们推测ERK1/2信号通路也可以通过影响宿主免疫微环境进而影响HBV感染相关性HCC的进程。Toll样受体4 (toll-like receptor 4，TLR4)可以将非特异性免疫和特异性免疫连接起来，发挥机体免疫功能。有研究表明，TLR4与HBV感染相关性HCC预后相关[12]。利用siRNA技术沉默HBV阳性的Hep3B肝癌细胞中的TLR4，发现ERK1/2和c-Fos蛋白的磷酸化下调并诱导G2/M细胞周期停滞和凋亡[13]从而抑制肝癌细胞增殖。这提示TLR4识别HBV，进而通过活化ERK1/2信号通路，促进了HCC的发生与发展。由此可知，ERK1/2信号通路通过调控HBX的蛋白、HBV的复制和宿主免疫微环境等方面，进而影响肝癌细胞。

3 JNKs信号通路与HBV感染相关性HCC

JNKs是由JNK1、JNK2和JNK3基因编码成的c-Jun氨基末端激酶，也被称为应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)。促炎因子和应激反应等均可活化JNKs，进而上调c-Jun、Jund及p53等的表达，发挥生物学效应。HU等[8]将JNKs抑制剂SP600125与携带有HBV病毒的肝癌细胞共培养后，发现JNKs、c-Jun和自噬相关蛋白等的表达均有下调，可见JNKs级联途径能通过促进肝癌细胞自噬，进而参与HBV感染相关性HCC的癌变进程。SP600125是非特异性JNKs抑制剂，可使3种基因型JNKs的表达均下调，那么不同基因型的JNKs对HBV感染相关性HCC的影响是否也有不同。LIU等[14]发现，下调HBV阳性的PLC /PRF肝癌细胞中JNK1/2和p-JNK1/2表达，通过免疫荧光法检测到肝癌细胞内MMP2的分泌和运输受阻，进而抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。因此，JNK1/2信号通路可能是通过调控HBV感染相关性肝癌细胞中MMP2的分泌及功能从而抑制肝癌细胞增殖和侵袭。虽然目前关于JNK3直接影响HBV感染相关性HCC发生、发展的机制尚无研究报道，但关于JNKs信号通路在HBV感染相关性肝癌病程中的重要性毋庸置疑。

LI等[15]在HBV阳性的Hep AD38细胞中通过Western boltting发现，HBV的复制水平与JNKs、p-JNK的表达呈正相关。抑制HBV转基因型小鼠体内JNKs信号通路活化，可在一定程度减缓HBV复制[16]。这些结果均提示，JNKs信号通路参与并促进HBV复制这一过程。HBV感染是HBV感染相关性HCC的基础环节，有效抑制病毒复制、控制病毒数量是延缓HBV感染相关性HCC进展的主要措施，JNKs信号途径在其中有重要意义。HAGIWARA等[17]在HBV感染相关性HCC患者肝癌组织中发现HBX高表达，且部分HBX基因型发生了突变，利用HBX基因突变型小鼠进行研究，发现HBX基因突变型小鼠体内JNKs信号途径的转录活性明显升高，被诱导发生HCC的几率更大。为了进一步明确HBX基因与JNKs信号通路的关系，以C-末端截短的HBX转基因型小鼠为模型，发现高表达的HBX蛋白上调IL-1和TNF-α表达，并进一步活化JNKs和ERK1/2信号通路，诱导HBV感染相关性HCC的形成[18]。可见突变型HBX参与HBV感染相关性HCC的过程，可能是通过上调某些炎症因子表达进而激活JNKs信号通路来实现。但WU等[19]通过培养稳定表达HBX的Hep3B-HBX肝癌细胞系，发现HBX可以激活JNKs/pSMAD3L信号传导，可能是通过抑制TGF-β的生物学活性并上调c-Myc表达水平，进而达到促进肝癌细胞增殖的目的。随后，利用JNKs抑制剂SP600125处理Hep3B-HBX肝癌细胞，发现TGF-β功能恢复且TGF-β/SMAD信号传导途径被激活，从而抑制c-Myc表达以此实现抑制肝癌细胞增殖的目的。在此过程中，HBX是通过激活JNKs级联反应并抑制细胞因子功能,进而影响HBV感染相关性HCC的发生。

4 p38MAPK信号通路与HBV感染相关性HCC

目前已知的p38MAPK异构体有5个，包括p38α、p38β1、p38β2、p38γ和p38δ，其中研究最清楚异构体的是p38α也称为p38，活化的p38MAPK信号通路可以参与应激反应和免疫系统调节过程[20]。HU等[8]研究发现，三联基序蛋白7(TRIM7)在肝癌组织中高表达且HBX能上调肝癌细胞中TRIM7表达，随后利用siRNA沉默HBV阳性的肝癌细胞中TRIM7，发现p38α、p-p38α的表达下调，p53和p21表达则明显增强。由此可见，在HBV感染相关性肝癌细胞中，HBX可以激活p38α、p38MAPK信号通路促进肝癌细胞的增殖。

大量研究结果表明，p38MAPK信号通路与HBV感染相关性HCC密切相关。YANG等[21]通过免疫荧光法观察HBV感染早期的HepG2-NTCP肝癌细胞，发现p38MAPK、p-p38MAPK和信号传导和转录激活因子3(STAT3)表达明显增强，HBV复制和肝癌细胞增殖均明显增加。HBV感染晚期，p38MAPK与细胞分化调节因子HoxA10结合迅速募集酪氨酸磷酸酶SHP-1，促进p38MAPK/ STAT3的去磷酸化，减缓HBV复制和肝癌细胞增殖。可见p38MAPK在HBV感染相关性HCC中有何种作用，与感染HBV的时间长短密切相关。TIAN等[6]干扰稳定表达HBX蛋白的Huh7-X和HepG2-X肝癌细胞，发现酪氨酸激酶受体EphA2水平升高且特异性激活p38MAPK 和ERK1/2信号通路，p-p38MAPK/p38MAPK、(p-ERK 1/2)/ERK1/2水平均明显升高。该结果进一步印证了p38MAPK在HBV感染相关性HCC进程中的作用，提示HBX可以通过上调EphA2表达激活p38MAPK信号通路，促进HBV感染相关性HCC的进展。HBX还可以通过将p38MAPK通路与其他信号通路串扰从而调控HBV感染相关性HCC的进程。AHODANTIN等[22]构建HBx转基因小鼠并诱导其发生肝癌，在诱发肝癌后的第15～17天内发现p38MAPK和ERK1/2表达水平同时升高，考虑可能是通过p38/ERK1/2信号通路促进肝癌细胞增殖。为了验证这一结论，利用p38MAPK抑制剂SB203508治疗小鼠后，发现p38MAPK和ERK1/2表达均明显降低，肝癌细胞增殖明显被抑制。这一研究结果揭示了p38/ERK1/2信号通路串扰在HBV感染相关性HCC的重要性。GAO等[23]将HBX的cDNA片段插入HepG2肝癌细胞中构建稳定转染的HepG2X细胞，用RT-PCR检测HepG2X细胞中某些受体的转录水平，与HepG2组比较发现Notch1水平明显上调。利用p38抑制剂SB203580与HepG2X共培养后发现，Notch1表达显著下调。由此推断，HBX通过激活p38MAPK信号通路上调Notch1的表达，进一步激活Notch信号通路促进肝癌细胞增殖和抑制其凋亡。综上可知，HBX可以激活p38MAPK级联反应，促进HBV感染相关性HCC的发生、发展。

5 其他因素与HBV感染相关性HCC

除MAPK信号通路外还有其他信号通路也参与了HBV感染相关性HCC的形成。如ZHENG等[24]在HBV感染相关性HCC患者组织中检测到SH2D5蛋白的表达明显升高，随后在HBV 阳性的HepG2.2.15 肝癌细胞发现HBX通过NF-κB信号促进SH2D5表达，进而促进肝癌细胞增殖。ZHENG等[25]在稳定表达HBX的肝癌细胞HL-7702-HBX中发现HBX通过激活COX-2 / Wnt β信号通路上调原癌基因cyclin-D1和c-Myc的表达，进而促进肝癌细胞增殖。LI等[26]在稳定表达HBX的肝癌细胞HepG2-HBX中发现当，HBX的表达下调，SHH信号通路中的hedgehog基因(SHH)、跨膜受体 (pch -1)和癌基因同源转录因子(gli)等表达均受到抑制，进而抑制肝癌细胞增。由此可知，HBX可以通过HBX/SHH级联反应抑制肝癌细胞增殖。HBX不仅可以激活MAPK信号通路诱导HBV感染相关性HCC的发生、发展，也可以活化其他信号通路来实现这一过程。HBX在HBV感染相关性HCC的发生中占有举足轻重的地位，但HBV的其他基因片段也可以影响HBV感染相关性HCC的进程。杨春霞等[27]收集临床HBV感染相关性HCC患者肝组织和血清用核酸扩增荧光定量及测序法检测，发现HBV基因型、变异位点1762/1764和1896、HBX之间存在相互关系，且与HCC的发生与发展有关。SONG等[28]利用siRNA技术沉默HBV相关性HCC细胞系中的S基因，发现白细胞介素-6的表达和转录激活因子3(Stat3)磷酸化水平均下调，进而抑制肝癌细胞的增殖，揭示了HbsAg可能是通过IL-6/Stat3信号通路诱导肝癌细胞增殖。由此可知，HBV基因组中的不同基因片段可以通过活化不同的信号通路影响HBV感染相关性HCC的发生、发展。

综上所述，MAPK信号通路的活化在HBV感染相关性HCC的发生过程中发挥着重要作用。其中，ERK1/2信号通路主要促进肝癌细胞的侵袭和迁移、JNKs和p38MAPK信号通路则主要影响肝癌细胞的自噬和凋亡。虽然MAPK家族中各亚通路均可从不同的方面调控HBV感染相关性HCC的发生、发展，但每条亚通路的功能并不是完全独立的，它们之间相互调节形成复杂的信号通路网络并影响HBV感染相关性HCC的进程。如前文提到的p38/ERK1/2信号通路信号通路可显著促进肝癌细胞的增殖。由此可以推测，通过信号通路之间相互串联、互相作用，可以进一步放大某些细胞因子并促进HBV感染相关性HCC的进展。因此，寻找信号通路网络中的关键信号通路并加以阻断，从而影响某些关键细胞因子的合成和分泌，这将为攻克HBV感染相关性HCC提供新思路。