膜融合的研究进展及其在药物运输方面的应用

苏莹莹 李春艳 李迪

摘 要 膜融合对于生物体的生命活动具有重要的调控作用。细胞内的膜融合在生物体的整个生命周期中发挥了促进细胞内物质运转的作用，病毒和细胞膜的融合可能标志着生物体生命的终结。然而，由于活细胞的复杂性，对细胞内膜融合过程的认识仅局限于少数细胞膜上的蛋白结构，如可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子附着型的蛋白受体（Soluble N-ethyl maleimide sensitive factor attachment protein receptors，SNARE）及其在促进膜融合中的作用。为更好地研究膜融合的机理，常用相关人工模型系统模拟生物膜融合。本文对SNARE促进膜融合的机理、DNA及卷曲螺旋多肽介导的膜融合研究进展，以及膜融合在药物运输等方面的应用进行了概述。

关键词 膜融合; N-乙基马来酰亚胺敏感性因子附着型的蛋白受体; DNA; 评述

1 引 言

生物膜融合是一种常见的细胞生理现象，对调控生物分子的运输、摄取及释放具有至关重要的作用[1]，如膜融合调控神经元之间的信号传导过程、细胞内的胞吞和胞吐过程[2]、病毒转染[3]和囊泡转运过程。生物膜上的蛋白和其它生物大分子之间的静电斥力使生物体内生物膜之间的距离在10～20 nm之间。因此，膜融合的第一步是拉近生物膜之间距离至几个纳米。膜的紧密接触伴随着磷脂双分子层结构的局部破坏，导致柄状结构的形成。在茎的中间部分，距离较近的脂质双层膜的外膜首先发生融合。通常认为，茎可扩张成半融合隔膜，其内层脂质是分开的。在最终的脂质重排过程中，半融合柄或者隔膜形成一个小孔，随着融合的进行，这两个小孔逐渐增大，使最初的两个脂室变成一个，并将各室所包含的物质混合在一起，完成融合过程，如图1A所示[4]。尽管细胞内的膜融合和病毒融合的蛋白质机制有很大的不同，但在融合过程中发生的脂质双层间的物理变化是相似的。一般认为真核细胞中的膜融合是由可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子附着型的蛋白受体（Soluble N-ethyl maleimide sensitive factor attachment protein receptors，SNARE）控制。膜融合的大部分数据是基于SNARE蛋白研究获取的[5，6]。膜融合过程发生之前，膜上的两组蛋白分别由两个卷曲螺旋区域组成，相互作用形成具有四螺旋结构的SNARE复合物，如图1B所示。SNARE蛋白在膜融合过程中所起作用可由两种机理解释：蛋白将两个磷脂层拉在一起，促进半融合及全融合过程，如图1A（a）; 另一种，SNARE先分别在单边的跨膜区域形成融合孔，当融合孔扩大后，跨膜区域会分开，磷脂参与融合孔中，继而发生融合，如图1A（b）。研究表明，SNARE复合物可将两个分子膜拉近至2～3 nm[7]。

研究膜融合的主要方法有以下两种： 第一种方法是使用已知的融合蛋白。这些蛋白可在体外进行表达，也可用于体内的融合系统。由于体内系统中有很多蛋白参与此过程，所以在体内很难将某种蛋白的影响进行独立研究。此外，由于生物体内部组成的复杂性，体内的脂质重组研究也常会得到对立的结果。如生物体内常存在密度不均匀的蛋白质及大小不均匀的脂质体等，这些都会导致不稳定融合事件的发生。第二种方法通过合成触发膜融合的类似物，深入了解蛋白质诱导的膜融合的发生机制。常见的膜融合类似物包括源于自然蛋白的膜融合肽及利用互补的DNA链。在膜融合肽诱导的膜融合过程中，多肽在脂质双层中以螺旋结构存在，导致脂质膜不稳定，促使其发生融合。如病毒和细胞的融合（图1C）[4]，两种融合膜之间没有特异性识别分子，只是融合肽和磷脂膜之间的相互作用即可促进膜的融合。而DNA链诱导的膜融合则是通过锚定在不同脂质膜上的DNA碱基互补配对促进膜融合。DNA分子链具有高度选择性且易于合成的优点，DNA纳米技术具有可编程性，将膜融合和DNA相结合，拓宽了膜融合的研究领域。Hook等曾通过对DNA链进行胆固醇功能化修饰，将DNA链轻易地嵌入磷脂双分子层中，然后利用互补的DNA分子链之间的杂交反应将两个脂质膜结合在一起[8]。

2 SNARE促进膜融合的机理研究

在生物学上，融合蛋白作为促进膜融合的催化剂可帮助两个生物膜克服融合过程中生物膜之间的排斥力，进而促进膜融合[8]。常见的融合蛋白有SNARE蛋白及病毒融合蛋白[9]。SNARE蛋白是一类生物膜上细胞间特异性和细胞质靶向蛋白的总称，SNARE假说认为SNARE蛋白由囊泡（v-）SNARE、目标（t-）SNARE、N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性的融合蛋白（N-ethylmaleimide-sensitive factor，NSF）和細胞质内的可溶性NSF附着蛋白（Soluble NSF attachment protein，SNAP）组成。即使在NSF和SNAP不存在的情况下，囊泡（v-）和目标（t-）SNAREs也会形成稳定的结构[11]。囊泡融合是最早发现的SNARE介导的一类膜融合，在融合过程中，SNARE蛋白的复合结构可诱导后续的膜融合，SNARE蛋白由疏水的碳末端跨膜域和水溶性的N端区域组成。在识别过程中，最初未结构化的SNARE模体自组装成四螺旋束，这种四螺旋束能被特定的蛋白解离。通常，螺旋束从氮末端开始形成，之后像拉链一样向跨膜区移动，这种移动过程会对脂质膜产生压力，促进融合孔的生成，继而发生膜融合。病毒融合蛋白对于病毒进入细胞的过程起重要作用。病毒入侵细胞的过程，首先是包裹在病毒周围的融合多肽先嵌入宿主细胞的细胞膜，使融合蛋白的结构发生改变，继而推动两个生物膜发生融合。融合多肽也可通过扰动宿主细胞膜的结构促进膜融合，这与SNARE蛋白的组成几乎相似，即融合蛋白产生一个内在的力，推动两个生物膜发生接触，最后导致膜融合。

此外，研究发现，具有卷曲螺旋序列的SNARE模体，可通过相互之间的平行作用形成SNARE复合结构，如图2所示[12，13]。这种复合结构紧邻跨膜区，表明SNARE复合结构的自组装可将突出囊泡和脂质体膜结合在一起，SNARE复合结构可提供膜融合所需能量。随后，神经元的SNARE结构被证实是由4个平行的α-螺旋组成，2个来自SNAP-25，另外2个分别来自突出融合蛋白和突触泡蛋白，不同膜上SNAREs蛋白的表征显示SNARE结构具有相似的四螺旋柱状结构。

3 天然膜融合蛋白类似物促进膜融合的研究

3.1 通过DNA修饰的脂质体研究膜融合过程

生物膜融合由SNARE家族蛋白严格调控，转运小泡和目标蛋白分子间通过特异性识别发生相互作用，生成SNARE蛋白复合物，促使组成细胞膜的磷脂进行重组，使相邻的脂质层发生融合。受SNARE促进膜融合机理的启发，Stengel等[8]利用胆固醇修饰的DNA链模拟这种识别过程，如图3A所示，疏水端的胆固醇可自发地嵌入磷脂层，并作为DNA嵌入磷脂层的锚定端，这种胆固醇修饰的DNA链具有定向性，使雜交发生在链式区，具有互补序列的DNA链修饰的囊泡被拉近，进而促进膜融合。研究发现，嵌入膜内的DNA链的数量对膜融合的速率有很大影响。混合磷脂具有较高的融合效率和融合速率。 Beales等[14]的研究表明，DNA作为可促进膜融合的配受体对，其螺旋的稳定性受内膜的表面张力调控，并且脂质组成对嵌入脂质体表面的互补DNA的融合温度有很大影响。

2009年，Chan等[15]研究了不同DNA链的序列对DNA介导的膜融合的影响，通过在DNA链的不同端修饰磷脂，嵌入脂质层之后的互补DNA可形成反向平行杂交，这种杂交方式可拉近两个膜。然而，在2007年，他们在单个囊泡与基底脂质层融合的实验中观察到，由磷脂修饰的DNA介导的膜融合过程中，70%的膜融合处于半融合状态，只有5%的融合处于全融合状态，如图3B所示[16]。他们认为，这可能是锚定在磷脂膜的DNA的甘油醚只插入了磷脂层的一半，半融合后，磷脂修饰的DNA在目标膜中处于自由扩散的状态从而远离脂质体。为了验证这个猜想，他们引入茄尼醇修饰的DNA，茄尼醇是一类C45的类戊二烯醇，当茄尼醇只存在于发生融合的其中一个囊泡或者两者都有时，膜融合的速率提高了2～3倍，这些结果表明跨膜的锚定基团可提高膜融合的效率。

磷脂修饰的DNA链不仅能诱导膜融合，而且可辅助SNARE介导膜融合。2015年，Xu等[17]利用磷脂修饰的DNA实时调控SNARE在膜融合中的作用。磷脂修饰的DNA链由21个碱基对组成，将其嵌在膜远端，通过碱基之间特异性互补杂交可将两个脂质体桥连在一起，嵌入在膜近端的一条链用于控制脂质体之间的间隔距离。利用DNA的互补配对拉近膜距离的同时，t-SNARE和v-SNARE随着距离的拉近发生相互作用，从而形成SNARE复合物，当DNA的碱基数低于40时，可得到最大融合效率。作为一种操纵本地蛋白程序化的工具，磷脂修饰的DNA可用于调控其它生物过程。2018年，Sun等[18]利用DNA编程介导的膜融合策略，发展了向活细胞细胞质内有效递送蛋白质的方法。

在DNA介导的单个融合事件的研究手段成熟之后，Loffler等[19]利用DNA的可编程性研究了膜融合的级联反应。磷脂修饰的DNA介导的膜融合为自上而下地构建纳米反应器提供了一个模板。DNA介导的级联膜融合所需温度低至50℃，这对于研究在脂质体限域的水相反应中调控水的活性对反应的影响有极大的应用潜能。有效的程序融合可促进新的自下而上合成生物学技术的发展，如多成分人工细胞系统技术。这种具有靶向细胞膜特定位点脂质体的融合技术在药物靶向及基因传递方面有重要的应用前景。

随着DNA技术的发展，DNA纳米结构在细胞膜上的自组装已成为一个强有力的研究工具[20]。与天然的生物膜相比，合成的磷脂膜结构比较简单，更利于模型构建[21]。2017年，Peng等[22]在模拟细胞微环境的脂质体膜上，实现了DNA纳米柱的自组装及自组装的解离的过程。具有DNA手臂链的三维DNA纳米柱可通过胆固醇修饰固定在膜表面。通过DNA链之间的杂交及脚手链介导的链置换可有效地调控DNA纳米柱的自组装。

3.2 利用卷曲螺旋多肽建立的膜融合研究模型

以上研究方法多是模拟了膜融合的过程，简要概括了膜融合的基本特征。这些研究所用的模型多是脂质体和脂质体的融合，并未将融合事件扩展至活细胞的研究上，这在很大程度上限制了膜融合在药物递送方面的研究。2016年，Mora等[23]受SNARE蛋白结构启发，建立了利用卷曲螺旋肽互补的相互作用进行完全人工模拟的靶向膜融合模型。这个模型和SNARE介导的膜融合有类似的关键性特征。

超分子化学的发展为功能材料的设计提供了很多便捷方法。细胞膜内的蛋白由于相互间的静电斥力而很难发生相互作用，大分子之间的疏水相互作用则可弥补这方面的不足。基于蛋白质之间的疏水相互作用，可对膜融合进行特异性调控[24]。设计互补的卷曲螺旋组成脂肽嵌入脂质体膜中，可有效且快速调控靶向性膜融合[23，25～28]。此类膜融合脂质体是通过将磷脂和脂肽融合在有机溶剂中制备[27]。 Versluis等[29]设计了一种可基于互补脂肽对的，快速促进膜融合的超分子系统。他们通过向普通脂质体中添加水溶性的两亲性多肽诱导脂质体膜融合。这种方法和常见的脂质体制备的方法截然不同，普通脂质体多基于融合肽、糖类、糖肽类及DNA复合物等，该方法可用于脂质体和细胞膜的融合及细胞膜的刺激活化等[30]。

2013年，Zope等[31]利用光敏材料对促进融合的肽进行屏蔽，光敏材料的光诱导效应可很快地去屏蔽，使肽链发生相互作用，从而促进两个脂质体膜进行融合，实现可控融合（图4A）。2016年，Kong等[32]设计了一种基于卷曲螺旋组成的肽，通过其互补作用，靶向促进膜融合（图4B）。两种卷曲螺旋肽分别为E和K，通过将E和K脂质体混合在一起，膜融合可自发地进行。在自然界中，膜融合受时间和空间的高度调控，从而保证融合的正确发生，维持生物体机能的正常运转。同样，其融合特性可用于载药和基因运输的膜融合系统，从而控制膜融合发生的时间和部位。

4 膜融合研究在药物运输方面的应用

穿膜肽和脂质体由于其良好的生物相容性和非入侵性而广泛应用于药物运输的研究。脂质体的尺寸通常小于1 μm，是研究生物或生物物理膜性质的常用模型; 另外，由于其生物相容性及低毒性，常被用作药物运输系统。功能化修饰的脂质体可向细胞质内转运小分子，常见的功能分子有带正电的磷脂、聚合物、抗体、细胞穿膜肽等。将水溶性的药物分子包裹在脂质体内也是常用的药物运输方法，但有关将亲脂性的药物包裹在脂质体内实现药物运输的研究报道较少。受细胞膜上SNARE蛋白的启发，Mora等[23]开发了一种药物运输系统用于靶向膜融合（图5A），膜融合系统由两条互补的两亲肽组成，两条肽分别嵌在不同的膜上，其互补后形成的卷曲螺旋复合物可将两个对立的细胞膜拉至较近的距离，从而促使膜融合的形成。

2017年，Yang等[33]利用脂质层包裹的介孔二氧化硅纳米颗粒，通过膜融合介导细胞内蛋白质的传递。蛋白质向细胞质的运输是纳米医学领域的一个具有挑战性的课题，因为细胞摄取和溶酶体逃逸的效率很低，阻碍了其在临床上的应用。该工作设计了一种含有大孔径（10 nm）圆盘状腔的二氧化硅纳米颗粒（MSNs），用于细胞内蛋白质递送的研究，并以细胞色素C（cytC）为不透膜的蛋白质研究模型。为确保胶体的稳定性，MSNs表面涂覆了一个融合脂质双层（LB），细胞摄取由一对互补的卷曲螺旋肽诱导。卷曲螺旋肽诱导的膜融合可使细胞色素C有效地进行细胞递送，并引发细胞凋亡。在内吞抑制剂的存在下，这些LB涂层MSNs的有效传递表明膜融合是细胞摄取的主要机制。这种用卷曲螺旋肽介导膜融合对于细胞内有效递送无机纳米粒子或蛋白质具有普适性。2018年，Bi等[34]利用脂质包裹的磁性纳米颗粒实现了磁场引发的药物释放，这种新的药物递送方法对于癌症治疗具有很大的应用潜力。

互补的卷曲螺旋组成的肽链，如E4（（EIAALEK）4）和K4（（KIAALKE）4），其和脂质体相连可组成一类常见的膜融合引发剂。受此启发，Yang等[35]首次将这种卷曲螺旋肽用于药物运输，制备E4肽修饰的脂质体，并在其中包裹远红外荧光素TOPRO-3碘负离子（E3-Lipo-TP3），结果表明，E4脂质体可向膜表面表达K4肽的Hela细胞递送TP3分子。此外，他们用脂质体包裹E4-Lipo-DOX，证实该方法还可向细胞内递送DOX（图5B）。将GUV（70% POPC和30%胆固醇）包裹的0.8 mmol/L光泽晶荧光染料和脂肽1孵育，得到功能化的GUV，随后形成的二聚卷曲螺旋结构可促使脂质体的融合，从而实现目标转运体3的靶向递送。最后，在溶液中加入NaCl转运体3，将外部的氯化物转化为内部的盐，导致脂质体内荧光素猝灭。研究表明，与游离的阿霉素相比，E4-Lipo-DOX具有更强的细胞毒性。为了证明E4/K4卷曲螺旋结构适用于体内的药物运输，他们将E4-Lipo-DOX和E3-Lipo-TP3注射进入移植有Hela-K的斑马鱼体内，结果表明，E4脂质体可进入Hela-K细胞，E4-Lipo-DOX可抑制癌细胞的增殖。因此，卷曲螺旋结构可有效且有选择性地用于体内的药物运输。

5 总结与展望

脂质转染试剂及电穿孔试剂盒的开发研究对于细胞和活体的研究至关重要。然而，细胞及生物体是一个极其复杂的微环境，现有研究方法常具有复杂的机制，且其对细胞行为的影响不可预测。膜融合是所有生物体内时刻都在发生，并且对于维持生物体的生命活动具有重要调控作用的事件，严格调控神经突触的传导、内吞、胞吐等生物过程。理解膜融合的基础生物物理过程不仅有助于深入了解生命過程，而且能为材料科学开辟一个新的途径，同时为药物设计和基因的传导提供一个强有力的工具。另一方面，膜融合和其它技术的结合，如DNA纳米技术等，可很大程度上促进膜融合领域的发展。但是，生物膜的组成并不像现有的研究设计模型那么简单，其表面含有大量的蛋白及糖类，微小的刺激可能会引起细胞应激反应，而现有的研究方法并不能对所有细胞产生的行为进行合理的解释。建立正确的膜融合系统，使其组成更加接近真实的生物状态，有助于深入了解生物的生命过程。

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