纸基微流控样品预富集技术与应用研究进展

梁斯佳 毛基锴 龚晨 于东冬 周建光

摘 要 样品预处理是分析检测的重要环节，尤其对于原始浓度低的样品，预富集技术有利于提高分析方法的准确度，拓展应用范围。但是，常规样品预富集技术往往操作繁琐，且依赖昂贵设备，检测时间和成本随之增加。纸基微流控样品预富集技术具有易制备、低成本、高效率等优点，简化了操作过程，降低了检测成本。本文重点介绍了近年来纸基微流控样品预富集技术与应用的研究进展，包括富集原理、纸基材料选择与装置结构设计及应用，并对此技术的发展趋势进行了展望。

关键词 纸基微流控; 样品预富集; 动电堆叠; 评述

1 引 言

样品预处理在分析检测中具有至关重要的作用。相比传统实验室检测技术，现场快速检测技术面对突发事件可进行快速应急检测[1，2]，近年来已广泛应用于临床诊断[3～5]、食品安全[6～8]和环境监测[9，10]等领域。然而，现场快速检测所面对的样品成分通常十分复杂，并且有效信息物含量较低，如不进行样品预富集，常难以满足检测需求[11，12]。而传统实验室样品预处理方式耗时较长，且依赖昂贵仪器设备[13，14]，不仅会增加分析检测的成本，还会限制现场快检技术在资源贫乏地区的应用。为解决上述问题，

研究者致力于易操作、低成本的样品预富集技术的研究。纸基微流控样品预富集技术以其易制备、易操作、低成本、高效率、便携性强、环境友好、可降解等优点成为该领域的研究热点。基于Web of Science的出版数据分析（图1），纸基微流控样品预处理的相关研究近年来发展迅速，自2010年以来文献数呈逐年增多的趋势。

纸基微流控技术以纸为基底，通过特殊加工，利用纸纤维形成的微通道完成微分析过程[15]。纸基材质成本低、亲水性好，无外力驱动即可完成样品的储存、混合和流动，并且反应活性高，生物相容性好，相对固相微萃取的填料更易进行洗脱[16～18]。研究者充分利用纸基材料的优质特性，结合多种富集原理，研发纸基微流控样品预富集技术与装置，不仅可满足现场快速检测的需求，还能作为其它先进的分析设备（如液相色谱或质谱）的离线样品预处理装置，缩短了分析时间，提高了检测效率。本文介绍了纸基微流控样品预富集原理，总结了纸基微流控样品预富集技术近年来的研究成果，包括纸基材料的选择与装置的结构设计以及技术的新应用，最后对本研究领域的发展前景进行了展望。

2 纸基微流控样品预富集原理

纸基微流控样品预富集技术有效利用纸基材料的特有性质达到富集目的。纸基孔隙率高、孔径小，可作为拦截吸附的材质; 纸纤维纵横交错所形成的三维网状结构为液体提供了微通道，在无外驱动力时可依靠毛细作用力引导流动; 纸基的主要成分为纤维素，纤维素含有羟基和羧基等活性基团，因此可对纸基进行化学修饰，提高富集的选择性; 纸基在电场作用下会产生电渗等动电效应，促进带电分析物的动电堆叠[19，20]。纸基微流控样品预富集原理主要有以下几种：过滤吸附、尖端富集、双相层析、蒸发浓缩、选择性捕获、静电作用和动电堆叠。

2.1 过滤吸附

过滤吸附富集原理是利用纸基作为滤膜，在流体通道内吸附拦截分析物，提高单位体积内分析物的含量，该方法常需外界设备来提供辅助驱动力。Walsh等[21]为从大体积低浓度的样本中富集目标细胞，外部搭载离心设备，采用离心力驱动样品，用带有一定弧度的纸基作为过滤吸附目标细胞的富集区。在离心力的作用下，样品中的细胞向外扩散并被纸基条带拦截，最终富集在纸基材料上，其浓度可满足荧光检测的要求。上述方法虽能处理大体积样品，但需外部驱动，便携性不强。Tang等[22] 将基于膜过滤的透析富集方法与免疫层析试纸条结合，采用玻璃纤维、半透膜和聚乙二醇溶液制作纸基样品预浓缩装置，富集10 min后，将免疫层析试纸条的进样垫与含有试样溶液的半透膜接觸，通过毛细作用力引入样品产生比色信号。富集后，HIV病毒核酸和肌红蛋白的检测信号均明显增强。该方法简单、廉价且便携性强。

2.2 尖端富集

尖端富集原理利用纸带末端尖角的收敛作用结合层析过程，通过溶剂带动分析物不断涌向纸基顶端，使分析物最终汇聚在尖端形成高浓度富集区，Xu等[23]利用此原理（图2A）对罗丹明6G和结晶紫进行富集，表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman Scattening，SERS）的检出限分别可达1×1020 mol/L和1×1019 mol/L。 该富集方法虽然针对低浓度样品富集效果好，但是耗时较长。

2.3 两相层析

两相层析富集原理是不同体积配比的两相水体系（Aqueous two-phase systems，ATPS）[24]结合层析过程，最终因不相容而在纸基上分离，分析物会随其中一相侧流并富集在纸基的特定区域上。

Kamei课题组[25，26]利用3D纸垫进样井结构将优化后的两相体系与免疫层析试纸条结合，使均相溶液在流经纸基时可迅速分离成两相，完成预富集过程（图2B）。相比之前的双相体系，大大缩短了时间，避免了预富集和检测间的额外交互。该方法使针对转铁蛋白和疟疾蛋白生物标志物的检测灵敏度提高了10倍，并可处理血清样本。这种纸基微流控样品预富集技术缩短了检测时间，减少了干扰，但需谨慎选择两相溶液。

2.4 蒸发浓缩

当样本量大、浓度低时，通常采用蒸发纸基上的载液浓缩分析物。Wong等[27]采用局部加热促进溶剂蒸发的方法处理百微升级样品，从尿液中以20倍富集比提取结核病标志物（图2C）。该方法要求分析物热稳定性好，且需要外接加热设备。针对溶剂蒸发诱导的富集过程，Syms[28]结合毛细现象、层析过程、渗透蒸发等物理原理建立纸基蒸发预富集数学模型分析动态过程，通过实验验证理论推导，得出结论：纸基性质决定佩克雷系数，并影响富集效果，该过程不仅能富集分析物，还可实现多种分析物的分离。

另一种蒸发富集是利用咖啡环效应使分析物富集在咖啡环边界处，从而完成定点检测。Huang等[29]在室温下干燥SERS纸基底上的罗丹明6G液滴，形成咖啡环，比较咖啡环上与咖啡环内的SERS信号强度（图2D），发现分析物在咖啡环上的预富集效应对信号增强与复现性起关键作用，检出限可达3.75 nmol/L。但是，咖啡环的形成会受多种因素影响，且可控性低。

2.5 选择性捕获

选择性捕获富集原理是在纸基上修饰一些可特异性结合分析物的物质，利用化学键、极性、静电结合等作用力捕获分析物造成堆叠，提高富集选择性。如Byrnes等[30]在硝化纤维素和玻璃纤维制备的纸基上修饰一种通过静电作用而对DNA具有捕获效果的线性多糖壳聚糖。利用吸水衬底带动含有DNA的样品侧流，流经特定区域时，DNA与壳聚糖结合并停止流动，达到富集目的（图2E）。该方法可通过控制调节pH值，使DNA从纸基富集区洗脱释放。洗脱后的DNA浓度无需纯化，可直接进入下游分析过程，进行扩增操作。

2.6 静电作用

静电作用富集是利用静电力富集分析物，Abbas等[31]创新性地在SERS检测纸基上修饰带电聚合物，如带正电的聚丙烯胺盐酸盐或带负电的聚苯乙烯磺酸钠，纸基被裁剪为带有尖端的多角形状，样品滴加在纸基中心（图2F）。当分析物电性与修饰的聚合电解质相同时，会在静电斥力作用下富集在角状分支的底部; 反之则会在静电引力作用下富集在角状分支的尖端。研究者还利用这种现象，完成了混合物的富集与分离。该富集方法对SERS检测信号具有明显增强作用，但无法应用于电中性物质。

2.7 动电堆叠

动电堆叠（Electrokinetic stacking，ES）利用电压驱动带电分析物，在多种动电效应下完成富集过程，常用于生物大分子（如蛋白质、核酸等）可带电的分析物的富集分离。

纸基材料除了提供毛细管路也会引发电渗现象参与动电堆叠。利用动电堆叠进行样品富集是近年纸基微流控样品预富集的研究热点。该类方法富集效率高、可控性强、耗时短，很大程度缩短了整个分析过程的时间。应用在纸基微流控样品预富集的动电堆叠有以下几种模式：等速电泳（Isotachophoresis，ITP）、等电聚焦（Isoelectric focusing，IEF）、场放大样品堆叠（Field amplified sample stacking，FASS）和离子浓差极化（Ion concentration polarization，ICP）。

2.7.1 ITP 等速电泳（ITP）是毛细管电泳常用的富集方法，也是较早在纸基微流控上成功实现的技术。ITP是一种不连续介质电泳技术，依靠各介质间离子淌度的差异完成样品富集。分析物经过电泳分离达到稳定后，最终被压缩为一个极窄的区带，以达到富集目的，并可通过调控分析物前后介质的离子淌度控制富集效果[32，33]，原理如图3A所示。

Moghadam 等[34，35]将ITP应用在纸基微流控上，通过降低表面蒸发与焦耳热进行优化，在短时间内高效富集，甚至可从100 μL的大体积样品中萃取出60%的分析物。该装置仅靠电池供电，具有较强的便携性。此富集方法还可应用在免疫层析试纸条上，在90 s内完成免疫球蛋白的富集，并使比色法的检出限改进两个数量级。

2.7.2 IEF 等电聚焦（IEF）主要用于蛋白质的预浓缩。该方法是根据蛋白质分子等电点的不同，在一系列pH梯度中，蛋白质通过电场作用迁移到与其等电点相同的pH区域，此时蛋白质不再带电，停止迁移，由此完成分离与富集[36，37]（图3B）。Niu等[38]利用IEF原理，在纸基上完成了蛋白質富集与分离过程。利用纸基条带形成IEF通道，侵润羟乙基纤维素以避免快速蒸发。在纸带上形成稳定的pH梯度，并施加直流高压进行富集操作。该纸基微流控预富集装置可在6 min内完成对牛血红蛋白的富集。当不同蛋白质的等电点差异高于0.03时，还可利用IEF在纸基上进行分离。该样品预处理方法经济有效，在临床疾病诊断和生物标志物分析方面具有潜在用途。

2.7.3 FASS 场放大样品堆叠（FASS）是基于电场强度不同，引起分析物电泳速度的改变，从而堆叠富集在毛细管区带电泳界面处[39，40]。该富集原理需要保证被富集物的电导率低于背景缓冲液（图3C）。

Wu课题组[40～42]首次将场放大样品堆叠引入纸基微流控，并产生反向电渗促进样品富集，成功地在300 s内完成了的对荧光探针和双链DNA的富集，并实现了3个数量级的信号增强 [40]。该课题组还验证了背景缓冲液中阳阴离子与电解水中的OH/H+离子的酸碱滴定反应在富集过程中的重要作用[41]。

2.7.4 ICP 离子浓度极化（ICP）是动电堆叠领域近年来的研究热点，具有操作容易、结构简单、成本低且富集倍数高的优点，在2～10 min内可富集102～103倍。ICP富集的原理如图3D所示，在外部施加电压时，具有离子选择性的膜会使其表面附近的电解液中离子浓度产生变化，膜一侧浓度降低形成耗尽区，造成通道内电场分布不均，最终导致带电分析物在不同位置迁移速度不同。在电渗和电泳的作用下，分析物运动最终达到平衡并堆积在耗尽区边缘形成富集[43～45]。

Sinton课题组[44～46]最早将ICP富集方法应用在纸基微流控上，利用蜡打印法制备纸基微流控预富集芯片，将离子选择性透过材料喷涂在纸基微流控预富集芯片的特定区域。该芯片针对荧光探针的富集可达40倍，对蛋白质、色素的富集可有效改善检出限，而单片纸基微流控预富集芯片成本仅0.015美元。

3 预富集装置中纸基的选择与结构设计

3.1 纸基的选择

纸基材料成本低、易制备、易折叠、结构疏松多孔且比表面积大，在无需外驱动的情况下，即可引导液体流动，同时又具有一定的反应活性，这些良好的特性使其成为分析检测及样品预富集的理想平台。传统意义的纸基材料是指由纤维素构成，通过浸润、烘干、压膜成型等一系列造纸技术制备的材料。随着材料科学中柔性基材的发展，研究者对“纸基”的定义不再局限于传统意义的纸基材料，已扩展至具有适当柔性或多孔结构的纸和膜。具有优异特性的新型膜材料已在微流控等众多研究领域中引起广泛关注[47]。在纸基微流控样品预富集装置中，常用的材料包括滤纸、硝化纤维素膜、玻璃纤维素纸、醋酸纤维素膜等。

通常根据被分析物和富集原理选取纸基材料，以保证有效富集。其中较为常用的是Whatman系列滤纸，该滤纸吸水性强，层析速度适中，价格低廉。如针对生物大分子进行富集检测，会选用生物兼容性较好、对生物分子结合能力强的硝化纤维素膜，该材质已广泛应用于制备免疫层析试纸条。商品化的硝化纤维素膜的结构和孔隙度可控，比色分析对比度高，已经被验证为动电堆叠的良好基材。玻璃纤维素纸则具有生物兼容性好、毛细管结构优良、耐燃性好、润湿性好、电渗透性能好等优点，常在动电堆叠和两相层析中被选为基材。有时为了减少对蛋白质的吸附，会采用醋酸纤维素膜作为基材。

3.2 结构设计与优化

根据不同的富集原理，纸基微流控样品预富集分析装置的结构设计也各有不同。采用纸基作为滤膜进行过滤吸附富集时，需考虑适配外界驱动设备。当利用离心力驱动液体样品[21]，通常将一定弧度的纸基通过压敏胶带围成样品通路，夹在两层塑料圆盘中，圆盘中心流入样品（图4A）。当用蠕动泵驱动液体时[48]，可将微型离心管盖子打孔，作为过滤吸附滤纸的支架和进样管通过塞子连接（图4B）。为了利用纸基尖端的收敛作用，尖端富集的纸基微流控装置常采用一端尖角的结构[23]。

近年来，纸基动电堆叠样品预富集引起研究者的关注。基础的纸基动电堆叠装置通常采用单通道连接双储液池的结构。然而，此类结构易受焦耳热影响，引发底液蒸发，甚至纸基烧灼。高效率与焦耳热间的综合考量成为结构优化的一个方向。为了减少焦耳热的产生，Bercovici课题组[49～51]利用数学建模与仿真对纸基上的ITP富集过程进行分析，最终通过降低纸基通道深度，使大电场与焦耳热间达到平衡（图4C）。该课题组还研究了电渗和ITP富集的之间的平衡模型，发现当分析物带负电时，可利用纸基的电渗作用缩短通道长度，同时，采用圆弧形电极代替直线电极进行优化，经验证优化结构后，富集效果明显提升。Yang的课题组[52～54]在ICP纸基微流控预富集芯片上引入多通道结构，实验结果表明，多通道结构收敛作用和汇集处的流动聚焦效应会促进样品的富集。该小组还通过双面蜡打印将纸基通道深度控制在50 μm，以此降低电渗速度与电压需求，改善富集效果（图4D）。

与2D纸基芯片相比，折叠式3D纸基芯片流速快，储液能力强，每层都可实现不同功能，这些优势为动电堆叠纸基微流控预富集芯片的设计提供了新思路。Li等[55]用折叠结构设计了一款基于ITP原理的纸基微流控预富集芯片，便于对富集后的样本进行回收和分析（图4E）。 Chou等[56]采用折叠结构增大了储液体积，并對离子选择性透过膜覆盖面积加以控制，减少样品损耗，降低电压需求（图4F）。Lee等[57]构建了折叠结构的ICP纸基微流控预富集芯片，通过折叠将进样区和富集区联通，富集后可减掉进样区，只保留富集区进行下一级检测。

研究者采用多种策略对ICP纸基微流控预富集芯片进行简化制备，有的甚至可省略蜡打印步骤和选择性透过膜的喷涂过程。Lee课题组[58，59]通过将蜡打印的纸基底与印有特定形状离子选择性透过膜的胶带粘和，制备ICP纸基微流控预富集芯片 （图4G）。他们还将离子选择性透过膜独立出来，嵌套在市售的免疫层析试纸条上，以提高检测灵敏度（图4H）[60]。Phan等[61]将裁剪好的纸基、铂电极与离子选择性透过膜贴合，并层压在有两个储液池开放口的塑料片上，制备一种不需要蜡打印的ICP纸基微流控预富集芯片; 利用Parafilm封口膜，只通过裁剪的方式制备ICP纸基微流控预富集芯片 （图4I）[62]，该方法增加了芯片的机械强度，相比开放式的芯片具有更好的富集效率，降低样品污染与表面样品蒸发。这种简单易操作的制备方法在大规模商业化生产方面具有潜在的应用前景。

4 纸基微流控样品预富集技术的应用

在常规实验室的分析检测中，纸基微流控样品预富集技术可作为一些分析设备的快速、低成本的离线样品预处理方法[42]。Niu等[38]采用纸基等电聚焦IEF预富集装置处理的蛋白质，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行了检测，结果表明，通过这种离线样品前处理后，复杂样品内含量极低的生物标志物可通过质谱进行高灵敏、高识别性的分析。近年来，基于纸基材料制备的SERS基底备受关注，研究者将纸基微流控样品预富集技术集成在SERS检测纸基底上，不仅可提高检测灵敏度，还在很大程度上改善了SERS检测的重现性[23，29，31]。

除了应用于常规实验室的分析检测，纸基微流控样品预富集技术作为一种经济、简单、便携的预处理技术，更适用于现场快速检测。如在环境监测领域，为了检测水中重金属的含量，Satarpai等[48]利用化学修饰后的纸基高选择性富集水中的Pb2+，随后将富集后的纸基作为进样端接入纸基芯片中进行比色检测，使水中Pb2+的检出限降低至μg/L级。Ouyang等[63]利用FASS富集原理，在6通道的纸芯片上并行分离和富集多个样品，结合显色反应，可高通量检测多种重金属离子，显著改善了检出限。在临床诊断中，纸基微流控样品预富集技术常用于核酸及蛋白质的检测分析。Tiwari等[64]在纸基上原位合成棒状ZnO纳米粒子，由于该纳米粒子具有很高的纵横比和表面覆盖率，为蛋白质的结合提供了更大的有效面积。结合蛋白质的酶联免疫吸附测定，修饰ZnO纳米粒子的纸基对肌红蛋白的富集可达3倍。 Gong等[45]利用ICP纸基微流控预富集芯片直接进行DNA分析，在10 min内完成乙肝病毒靶点DNA的富集、分离与检测; 之后，利用该芯片对精子染色质的完整性进行了检测[46]，定量分析了精子DNA碎片率和包装质量，该研究结果与临床诊断标准的结果相同，并且结构简单、成本低，分析快速灵敏。在食品安全领域，Wu等[42]利用FASS富集原理，制备出集成了样品富集与分离的纸基微流控分析装置，便携性好、速度快，适用于小分子食品染料和大分子蛋白质的富集。除上述应用外，Ma等[65]以织物纤维为基底，采用ICP技术开展了海水淡化的应用研究，该技术仅需施加15 V电压即可去除50 mmol/L NaCl溶液中85%的盐分，可用于在偏远或欠发达地区海水淡化。

基于智能手機的便携式现场快速检测装置已经成为纸基微流控样品预富集技术应用领域的重要发展方向（图5A），这类装置由纸基微流控样品预富集芯片、智能移动终端和外设硬件构成，其中智能移动终端具有控制计算、数据处理、人机交互等功能，并且可利用手机摄像头拍摄光学信号; 外设硬件可提供分析检测所需的光学通路与电学结构等。这类装置便携性强、成本低，是资源贫乏地区理想的现场检测平台。Wu课题组以FASS纸基微流控预富集芯片为核心集成了一种便携式荧光增白剂的定量检测装置[66]，成像检测系统由LED、光学显微镜片和智能手机固定集成，成功用于餐巾样品中荧光增白剂的快速测定（图5B）。该课题组通过引入其它光学检测元件提高灵敏度和线性范围，以实时监测比色反应。新集成的检测装置可完成唾液或水样本中亚硝酸盐的检测以及重金属离子的检测[67，68]。该课题组还研究了多种离子选择性透过膜的 ICP效应[69]，扩展了ICP纸基微流控预富集的应用，搭载LED和智能手机构建荧光图像检测系统。Li等[70]将ICP纸基微流控预富集芯片适配智能手机。利用智能手机的摄像头拍摄荧光图像，并开发图像处理专用应用程序，对荧光信号强度进行定量分析（图5C）。

5 总结与展望

本文介绍了近年来纸基微流控样品预富集方面的研究进展，包括富集原理、预富集装置中纸基选择与结构设计及相关应用。这项富集技术不仅可应用于常规实验室的分析检测，还可用于现场分析检测，降低检出限，提高灵敏度，拓宽了现场快速检测技术的应用领域。研究者通过优化结构、简化制备方法、积极扩展与其它检测平台的联用等多种方式不断完善纸基微流控样品预富集技术。纸基微流控样品预富集技术搭载智能手机构建便携式现场快速检测装置已经成为重要的发展趋势，是社区医疗、食品安全、环境监测以及资源贫乏环境下进行现场检测的理想平台。

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