苏打盐碱胁迫对两种苜蓿种子萌发影响及品种耐性综合分析

贾秀峰

(齐齐哈尔大学教师教育学院， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一种全球性栽培、适应性广泛、品质优良的豆科牧草，在干旱和盐碱环境下生长良好，可以作为绿肥改良土壤，有利于农业生态环境的改善[1]。盐碱土作为一种土壤类型分布广泛[2]，全世界的盐碱土地面积约有9.54×109亿hm2，主要集中于欧亚大陆、非洲、美洲西部[2]，我国的盐碱土地面积为9 913×104hm2，仅以黑龙江省大庆市为例，大庆市地处松嫩苏打盐渍区，共有盐碱化土壤2.87×105hm2,占全市土地总面积的59.4%，该区盐渍化土壤主要为苏打盐碱化土壤，其特点是pH值在8以上，NaHCO3含量高毒性大,是影响区域经济发展和生态恢复的重要因素[3-4]。碱胁迫比盐胁迫具有更大的生态破坏力，不仅影响植物的外部形态，也影响植物内部的生理生化特性[5]，造成叶绿素破坏，光合作用率急剧下降[6]，还会使淀粉分解，造成保卫细胞中糖分增多、膨压增大，最终导致气孔扩张而大量失水[7]，这些危害都会造成植物死亡。

盐胁迫最为敏感的时期为种子萌发期，这阶段的耐盐能力在一定程度上反映了植物整体的耐盐性[5]。目前对植物响应盐胁迫的研究多以中性盐(NaCl)为对象，对苏打土碱性盐如NaHCO3和Na2CO3的研究往往被忽视[8]。对于东北松嫩平原盐碱地来说，盐碱混合胁迫是在实际存在的主要问题，因此,提高盐渍化土地资源利用率，增加优质蛋白质饲料，可缓解畜牧业饲料短缺，为发展畜牧业奠定物质基础。本研究对苏打盐碱胁迫下紫花苜蓿的种子萌发特征进行研究和综合分析，为解决苜蓿种子萌发的盐害问题提供理论依据，既有助于深入了解其萌发的耐盐碱性，又为苜蓿在盐碱草地恢复过程提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以2016年收获的WL343HQ和龙牧807(MedicagosativaL.cv.Longmu No.807)两种紫花苜蓿种子作为试验材料，均由黑龙江省畜牧研究所提供。WL343HQ苜蓿粗蛋白含量 15.15%,粗纤维含量 32.43%,粗脂肪含量1.96%，秋眠级为3.9级，该品种产量高，适口性极好，饲用价值高，抗寒和抗病虫害能力强，适宜在我国山东、山西、河南等地区种植[9]。龙牧807苜蓿粗蛋白含量19.38%,粗纤维含量24.93%,粗脂肪含量1.89%，适口性好，饲用品质优良，其抗寒、耐旱性强，对病虫害也有一定的抗性,秋眠级为1级，生态适应性广,适宜在黑龙江省各地及毗邻省区推广种植[10]。

1.2 试验方法

1.2.1种子发芽试验 挑选籽粒饱满两种紫花苜蓿种子100粒，整齐摆放在平铺充分润湿的滤纸的发芽盒中，每组重复3次。摆放完毕后称重，记录重量以便每天通过补水维持胁迫溶液的种子的浓度。每天观察并记录发芽种子的个数。试验开始并于7 d后结束。随机选取10株芽苗测量每个芽苗的胚芽长、胚根长及10株芽苗的总鲜重。测量后的芽苗置于滤纸上阴干5 d，在80℃烘干箱烘干至恒重，测量芽苗干重。

1.2.2混合苏打盐碱胁迫苜蓿种子 按照NaHCO3∶Na2CO3=9∶1的比例配制苏打盐碱溶液(1mmol·L-1苏打盐碱含0.9mmol·L-1NaHCO3和0.1 mmol·L-1Na2CO3)，倒入平铺有滤纸的发芽盒中，使滤纸充分润湿(约20mL)。苏打盐碱胁迫浓度分别为20，25，30，35，40，45，50，55和60 mmol·L-1，对两种苜蓿种子进行不同浓度苏打盐碱胁迫，对照组则使用蒸馏水。试验结束后按照1.2.1步骤测量芽苗生长的相关指标。

1.2.3测定指标 发芽率(%)= G7/N×100%；

发芽势(%)=G3/N×100%；

发芽指数(%)(GI)=ΣG7/D7×100%；

活力指数=GI×S。

其中G3表示3 d内的发芽数，G7表示7 d内的发芽数，Dt表示相应的发芽日数，N为种子总数，S表示平均主根长度(mm)。

胚根长为每组发芽盒中10株长势均匀的萌发芽苗胚根的平均值，胚芽长为每组发芽盒中10株长势均匀的萌发芽苗胚芽的平均值，鲜重为每组发芽盒中10株长势均匀的萌发芽苗的总重量，干重每组发芽盒中10株长势均匀的萌发芽苗烘干后的总重量。

耐盐极限浓度(%)：以发芽率低于对照发芽率10%时相对应的复盐浓度为该植物种子耐盐极限浓度；

耐盐半致死浓度(%)：以发芽率达对照的一半时相对应的复盐浓度为该植物种子耐盐半致死浓度[11]。

1.2.4数据处理与分析 数据用SPSS 19.0和Excel软件进行统计分析，采用单因素方差分(ANOVA)和新复极差法(Duncan)比较同一品种的不同处理间的差异显著性，P<0.05时有统计学意义。数值为平均值±标准差。

X(ij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

注：X(ij)表示i种类j指标的隶属函数值；Xij表示i种类j指标的测定值；Xjmin表示第j个指标最小值；Xjmax表示第j个指标最大值。

2 结果与分析

2.1混合苏打盐碱胁迫对苜蓿种子萌发的影响

2.1.1发芽率和发芽势 WL343HQ和龙牧807苜蓿种子在不同浓度的混合苏打盐碱胁迫时，其发芽率和发芽势的变化见表1。从苏打盐碱对两种苜蓿种子发芽率和发芽势的影响变化分析，在同一苏打盐碱胁迫浓度下，WL343HQ种子的发芽率和发芽势均高于龙牧807。

两种苜蓿种子发芽率均随苏打盐碱胁迫浓度的增加呈下降的变化趋势，其种子发芽率均低于对照组，低苏打盐碱浓度对两种苜蓿种子发芽率下降幅度比较小，WL343HQ和龙牧807苜蓿种子在苏打盐碱浓度超过40 和35 mmol·L-1时严重影响了其种子的萌发。WL343HQ种子在45，50，55和60 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下，发芽率分别比对照组降低了55.72%，77.15%，82.86% 和95.71%，龙牧807种子在40，45和50 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下，发芽率分别比对照组降低了58.60%，73.43%和96.87%，苏打盐碱胁迫浓度为55和60 mmol·L-1时，种子的发芽率为0，说明此浓度下完全抑制了龙牧807苜蓿种子的萌发。除龙牧807种子在20 mmol·L-1苏打盐碱胁迫浓度外，其它苏打盐碱浓度下种子的发芽率均与对照差异显著(P<0.05)。

表1 混合苏打盐碱胁迫下苜蓿种子的发芽率和发芽势Table 1 Germination rate and germination potential of alfalfa seeds under mixed soda salt-alkaline stress

注：同列不同小写字母表示胁迫浓度间在0.05水平差异显著;“—”代表在胁迫处理下种子未萌发，下同

Note:Different normal letters in line show significant different among stress concentration at the 0.05 level;“—” indicates no germinate of seedings under stress treatment,the same as below

两种苜蓿种子发芽势均随苏打盐碱胁迫浓度的增大呈下降的变化趋势。WL343HQ苜蓿种子发芽势除25 mmol·L-1外，其它苏打盐碱浓度下发芽势均低于对照组，低苏打盐碱浓度对两种苜蓿种子发芽势下降幅度比较小，WL343HQ和龙牧807苜蓿种子在苏打盐碱浓度超过40和35 mmol·L-1时严重影响了其种子的发芽势。WL343HQ种子在35，40，45，50，55和60 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下，发芽势分别比对照组降低了51.16%，51.94%，79.85%，93.80%和99.22%，25 mmol·L-1苏打盐碱胁迫浓度下，种子发芽势比对照略有增加，高于40 mmol·L-1苏打盐碱浓度严重影响了其种子发芽的整齐度。龙牧807种子在35，40和45 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下发芽势分别比对照组降低了40.20%，69.07%和98.96%，20 mmol·L-1苏打盐碱胁迫浓度下，种子发芽势比对照增加了6.19%。在苏打盐碱胁迫浓度为50，55和60 mmol·L-1时，种子的发芽势为0，说明此浓度下前3 d完全抑制了龙牧807苜蓿种子的萌发。WL343HQ和龙牧807苜蓿种子在苏打盐碱浓度超过40 和35 mmol·L-1时，苏打盐碱胁迫组与对照组发芽势比较差异均显著(P<0.05)。

2.1.2发芽指数和活力指数 两种苜蓿在苏打盐碱胁迫下的发芽指数和活力指数变化见表2，受苏打盐碱胁迫苜蓿种子的发芽指数和活力指数均低于对照组，特别是在苏打盐碱胁迫浓度为40 mmol·L-1(WL343HQ)和35 mmol·L-1(龙牧807)以上时，两种苜蓿种子的发芽指数和活力指数均在50%以下，相同浓度下WL343HQ的发芽指数和活力指数均高于龙牧807。

在苏打盐碱胁迫下，WL343HQ种子的发芽指数的变化规律不明显，在胁迫浓度为40mmol·L-1以上时，严重影响了苜蓿种子的活力，导致种子的发芽指数显著下降。40，45，50，55和60 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下，其种子的发芽指数分别比对照组降低了55.73%，58.40%，83.16%，92.73%和98.18%。随着苏打盐碱胁迫浓度的增加，龙牧807种子发芽指数逐渐下降，在35，40，45和50 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下，分别比对照组降低了51.53%，71.98%，92.56% 和98.97%，55和60 mmol·L-1严重影响了苜蓿种子的活力，导致种子的发芽指数为0。除龙牧807种子在20 mmol·L-1苏打盐碱胁迫浓度外，其它苏打盐碱浓度下种子的发芽指数均与对照差异显著(P<0.05)。

表2 混合苏打盐碱胁迫下苜蓿种子的发芽指数和活力指数Table 2 Germination index and vigor index of alfalfa seeds under mixed soda salt-alkaline stress

随着苏打盐碱胁迫浓度的升高，两种苜蓿种子活力指数逐渐下降。WL343HQ种子的活力指数在20，25，30，35和40 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下分别比对照组降低了46.91%，57.10%，66.11%，67.54%和93.40%，龙牧807种子的活力指数在25，30，35和40 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下分别比对照组降低了49.08%，53.74%，85.53%和93.39%。45 mmol·L-1以上苏打盐碱浓度抑制苜蓿种子萌发，两种苜蓿种子的胁迫组的发芽指数与对照组比较差异均显著(P<0.05)。

2.2 混合苏打盐碱胁迫对苜蓿种子芽苗生长的影响

2.2.1胚芽长和胚根长 不同浓度苏打盐碱胁迫对WL343HQ和龙牧807芽苗胚根长和胚芽长的影响如表3，随着苏打盐碱胁迫浓度的增加，两种苜蓿种子芽苗的胚芽长和胚根长总体呈下降的趋势，而胁迫浓度高于45mmol·L-1时，两种苜蓿的芽苗由于腐烂死亡，导致无法测量其胚芽和胚根长度的变化。在相同苏打盐碱浓度胁迫下，WL343HQ的胚芽长和胚根长均长于龙牧807。

苏打盐碱在25，30，35和40mmol·L-1胁迫浓度下，WL343HQ芽苗的胚芽长分别比对照组降低了8.49%，10.75%，15.96%和62.67%，龙牧807胚芽长分别比对照组降低了14.47%，17.35%，25.01%和67.60%，当胁迫浓度为20 mmol·L-1时，WL343HQ和龙牧807的胚芽长分别比对照组增加了10.21% 和2.06%。除龙牧807种子在20 mmol·L-1苏打盐碱胁迫浓度外，其它苏打盐碱浓度下种子的胚芽长均与对照组比较差异显著(P<0.05)。

苏打盐碱胁迫浓度为20，25，30，35和40 mmol·L-1时，WL343HQ芽苗的胚根长分别比对照组降低了44.62%，52.51%，51.50%，58.39%和84.84%，龙牧807芽苗的胚根长分别比对照组降低了16.50%，41.27%，41.22%，74.03%和78.01%。两种苜蓿芽苗的胚根长胁迫组与对照组比较差异均显著(P<0.05)。

2.2.2干重和鲜重 不同浓度苏打盐碱胁迫对WL343HQ和龙牧807芽苗的干鲜重影响的变化见表4，随着苏打盐碱胁迫浓度的增加，两种苜蓿种子芽苗的干重和鲜重呈下降的趋势，而胁迫浓度达到45 mmol·L-1以上时，培养7 d的两种苜蓿的芽苗均死亡。在相同胁迫浓度下，WL343HQ的芽苗的鲜重和干重均高于龙牧807。

苏打盐碱在20，25，30，35和40 mmol·L-1胁迫浓度下，WL343HQ芽苗的鲜重分别比对照组降低了1.36%，5.31%，2.52%，19.66%和37.63%，龙牧807芽苗的鲜重在20，30，35和40 mmol·L-1胁迫浓度下，分别比对照组降低了2.61%，3.51%，28.25%和66.13%，25 mmol·L-1胁迫浓度时比对照组增加了4.28%，其后随着胁迫浓度增加龙牧807的芽苗鲜重逐渐下降。两种苜蓿芽苗的鲜重在苏打盐碱胁迫浓度为35和40mmol·L-1时，胁迫组与对照组比较差异显著(P<0.05)。

表3 混合苏打盐碱胁迫下苜蓿种子芽苗的胚芽长和胚根长Table 3 Embryo length and radical length of alfalfa seed buds under mixed soda salt-alkaline stress

苏打盐碱在20，25，30，35和40mmol·L-1胁迫浓度下，WL343HQ芽苗干重分别比对照组降低了17.80%，27.30%，18.26%，21.81%和57.90%，龙牧807芽苗的干重分别比对照降低了8.65%，3.95%，17.57%，32.50%和75.98%。两种苜蓿芽苗干重除在20 mmol·L-1(WL343HQ)和25 mmol·L-1(龙牧807)胁迫浓度下，其它胁迫浓度与对照组的芽苗干重比较差异均显著(P<0.05)。

表4 混合苏打盐碱胁迫下苜蓿种子芽苗的干重和鲜重Table 4 Dry weight and fresh weight of alfalfa seed buds under mixed soda salt-alkaline stress

2.3 苏打胁迫对苜蓿种子的耐盐碱半致死浓度和耐盐极限浓度的影响

耐盐半致死浓度是由低盐到高盐胁迫的中转浓度，是所有耐盐指标由低盐处理不规律变化到高盐浓度的受抑制过程中的一个“转折点”[5]。在一定苏打盐碱浓度范围内，两种苜蓿种子发芽率随胁迫浓度的增加而降低，苏打盐碱浓度过高可完全抑制苜蓿种子的萌发。为了确定两种苜蓿种子耐苏打盐碱适宜浓度，试验以种子发芽率作为苏打盐碱胁迫适宜浓度指标，对两种苜蓿种子的发芽率进行线性回归，回归曲线和回归方程见图1，确定两种苜蓿种子对苏打盐碱胁迫的半致死浓度和耐盐极限浓度，WL343HQ对苏打盐碱胁迫的半致死浓度和耐盐极限浓度分别为42.41 mmol·L-1和63.64 mmol·L-1，龙牧807对苏打盐碱胁迫的半致死浓度和耐盐极限浓度分别为36.61 mmol·L-1和54.33 mmol·L-1。

图1 苏打盐碱胁迫下2种苜蓿种子发芽率的变化Fig.1 Changes of germination rate of two alfalfa seeds under soda salt-alkaline stress

2.4 两种苜蓿种子对苏打盐碱抗性综合分析

两种苜蓿种子在混合苏打盐碱处理下种子萌发的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、胚芽长、胚根长、鲜重和干重8项形态指标变化不同，应用单一指标不能准确反映盐碱对苜蓿种子萌发的胁迫作用。对不同苏打盐碱浓度处理下的两种苜蓿种子萌发的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、胚芽长、胚根长、鲜重和干重的8项指标进行隶属函数值计算，将各项隶属函数值累加进行综合分析，苏打盐碱胁迫对2种苜蓿种子萌发的隶属函数值综合分析见表5。WL343HQ和龙牧801苜蓿种子萌发在不同苏打盐碱浓度处理下的隶属值的变化随着盐碱浓度的增加而降低，抑制种子的萌发和芽苗的生长，特别是在苏打盐碱浓度为40 mmol·L-1和35 mmol·L-1时，可以较好反映出苏打盐碱对两种苜蓿种子萌发的各项形态指标产生的影响。

表5 混合苏打盐碱胁迫对两种苜蓿种子萌发形态指标的隶属函数值综合分析Table 5 Comprehensive analysis of subordinate function values of mixed soda salt-alkaline stress on germination morphological indexes of two alfalfa seeds

注：GR，GP，GI，VI，EL，RL，FW，DW分别代表发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、胚芽长、胚根长、鲜重、干重

Notes：GR，GP，GI，VI，EL，RL，FW，DW represent germination rate，germination potential,germination index,vitality index,embryo length，radical length，fresh weight,dry weight respectively

3 讨论

盐碱胁迫是影响生物生长的重要逆境因素之一，通过渗透与离子毒害作用对种子萌发产生抑制作用，而碱胁迫对种子萌发的抑制在盐胁迫的基础上还增加了高的pH值作用，造成种子发生离子失衡，因此对植物种子的伤害作用更强[12]。Na2CO3和NaHCO3等碱性盐所造成的碱胁迫对植物的破坏作用大于由NaCl和Na2SO4等中性盐所造成的盐胁迫[13]。本试验中，随着苏打盐碱浓度的增加，两种苜蓿种子发芽率呈逐渐下降的变化趋势，WL343HQ在苏打盐碱浓度为20～35 mmol·L-1和龙牧807在20～30 mmol·L-1时苜蓿种子的发芽状况均表现良好，体现了两种苜蓿具有一定的抗苏打盐碱能力，当苏打盐碱浓度超过60 mmol·L-1时，两种苜蓿种子很难萌发。这与蔺吉祥[4]等人研究盐碱胁迫对紫花苜蓿种子发芽的协同影响的结果一致。高浓度混合盐碱胁迫抑制种子萌发可能是由于渗透和毒性效应，随着盐碱胁迫浓度的增强，WL343HQ和龙牧807的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均呈下降趋势，特别是在苏打盐碱浓度超过40 mmol·L-1(WL343HQ)和 35 mmol·L-1(龙牧807)以上时，严重影响了两种苜蓿种子的萌发。

通过模拟不同的苏打盐胁迫环境，发现苏打盐胁迫显著影响苜蓿种子发芽率、种子发芽进程和芽苗的发育，随着盐浓度的升高植物种子萌发一般受到抑制，高浓度则会明显抑制种子萌发[14-15]。在本研究中，只有在两种碱性盐(NaCO3+NaHCO3)为低盐碱浓度的胁迫条件下各项发芽指标与对照比较下降的幅度比较小，随着苏打盐浓度的上升，各项指标均呈明显下降趋势或抑制状态。种子萌发能力和芽苗早期生长是植物耐盐碱性早期鉴定及耐盐碱品种早期选择的基础。发芽率反映了种子发芽的速率，发芽势反映种子的质量优劣，发芽指数反映种子的发芽速度和整齐度，而种子活力指数是种子发芽速率和生长量的综合反映，应用这4个指标能够全面综合地反映外源苏打盐碱对苜蓿种子发芽的作用。

从胚根长、胚芽长、鲜重和干重的变化上分析，在低苏打盐碱浓度胁迫下，胚芽的发育受到促进作用，胚芽长、鲜重和干重下降的幅度小，而在40 mmol·L-1以上的苏打盐碱浓度对两种苜蓿种子的芽苗生长产生严重的抑制作用，与蔺吉祥等人研究盐碱胁迫对小麦种子萌发、早期幼苗生长结果一致[16]。特别是在45 mmol·L-1以上的苏打盐碱浓度下培养7 d的两种苜蓿芽苗生长缓慢，有的芽苗开始腐烂，说明高浓度碱性盐胁迫因其渗透胁迫、离子毒害和高pH值的综合影响[17-18]，对苜蓿种子的萌发和芽苗生长造成严重的伤害作用。

4 结论

在20，25，30，35，40，45，50，55和60 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下，两种紫花苜蓿种子除胚芽长度外，发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、胚根长、鲜重、干重均随苏打盐碱浓度升高呈下降的变化趋势，在相同胁迫浓度下，WL343HQ的各项萌发指标均高于龙牧807，WL343HQ和龙牧807对苏打盐碱胁迫半致死浓度分别为42.41 mmol·L-1和36.61 mmol·L-1，WL343HQ的耐苏打盐碱能力优于龙牧807。