两种检测水貂阿留申病毒抗体方法敏感性的比较研究

王振军，罗国良，易立，郭利，冯二凯，程世鹏，程悦宁

（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

水貂阿留申病（Aleutian Mink Disease，AMD）是由水貂阿留申病毒（Aleutian Mink Disease Virus，AMDV）引起的慢性、持续性传染病，该病严重影响水貂的毛皮质量，损害其生育能力，降低存活率，是危害水貂养殖业的重要疫病[1-2]。该病目前仍没有有效的疫苗来防控，检测和淘汰阿留申病貂是目前主要防控该病的方法。自该病报道以来，国内、外研究人员建立了碘凝集、对流免疫电泳（CIEP）、PCR、间接免疫荧光、ELISA 等诸多诊断方法[3-7]，其中，对流免疫电泳法是目前国际公认的水貂阿留申病诊断的黄金法则，但该方法操作步骤繁琐、耗时等缺陷，阻碍了AMD的检测在基层的普及和推广。

近年来，随着科技进步及新型诊断技术的发展，对水貂阿留申病的诊断开启了新的研究思路。水貂阿留申病的胶体金诊断法是近年新兴的水貂阿留申病快速诊断方法[8-9]，其检测简便、快速、准确的优点收到基层用户的广泛好评。本研究对新开发的水貂阿留申病毒抗体胶体金快速诊断试纸与水貂阿留申病的金标准检测法―对流免疫电泳法进行敏感性对比研究，以比较两种检测方法在检测敏感性方面的差异。

1 材料

1.1 试纸条

水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条由中国农业科学院特产研究所特种动物病原与免疫团队制备。

1.2 血清来源及背景

1.2.1 质控血清 水貂阿留申病毒阳性质控血清10份，对流免疫电泳效价≥1∶8，由中国农业科学院特产研究所制备、保存和提供。

1.2.2 田间血清 自然感染田间血清100 份，由中国农业科学院特产研究所试验动物基地采集，根据对流免疫电泳检测结果，将自然感染血清分为弱阳性（对流免疫电泳效价＜ 1∶8）和阳性（对流免疫电泳效价≥1∶8）。

1.3 对流免疫电泳抗原

由中国农业科学院特产研究所特种动物病原与免疫团队诊断制品实验室制备、标定、检测。

1.4 对流免疫电泳相关设备

高压双稳电泳仪 DYY-4C、卧式水平电泳槽DYCP-38C（北京六一仪器厂）。

2 试验方法

2.1 血清稀释

2.1.1 阳性质控血清 将10 份阳性质控血清ADVP1～ADVP10 样品各1 份，用样品稀释液按不同比例进行稀释，控制阳性质控血清对流免疫电泳（CIEP）效价1∶8～1∶16，取各个稀释度的血清5µL 进行检测。

2.1.2 弱阳性质控血清的制备 将10 份阳性质控血清用样品稀释液按不同比例进行稀释，控制阳性质控血清对流免疫电泳（CIEP）效价1∶0.125～1∶8，制备检测用弱阳性质控血清。

2.1.3 田间血清稀释 将对流免疫电泳检测确认的水貂阿留申病毒抗体效价田间血清倍比稀释，取1∶8～1∶64 稀释度进行试纸条检测。

2.2 试纸条检测与判定

取出适量的试纸条，取阳性质控血清、弱阳性质控血清、田间血清 5 µL 于加样孔，然后滴加 80 µL 稀释液（约3 滴），或直接滴加经稀释的血清3 滴，10～15 min内读取结果并记录。

3 结果

3.1 阳性质控血清试验结果

10 份阳性质控血清检测结果均为阳性反应，阳性血清效价在1∶8～1∶16 时，试纸条对阳性血清的检出率为100%，见表1。

表1 阳性质控血清检测结果Table 1 Test results of positive quality control serum

3.2 弱阳性质控血清试验结果

用试纸条检测法和 CIEP 检测法对10 份水貂阿留申病毒质控血清制备的不同稀释度（1∶8～1∶64）弱阳性血清进行检测，试纸条检测法对电泳效价范围在1∶8～1∶16 的血清1∶64 倍以下稀释时，其阳性检出率为100%，但随着稀释倍数的提高，试纸条质控线显色呈下降趋势；CIEP检测法对稀释度＜1∶32 的弱阳性样品的检测结果有较高的检出率，但对稀释度＞1∶64 的样品检测效率明显下降。结果见表2、3。

表2 弱阳性质控血清试纸条检测结果Table 2 Testing results of weak positive property controlled serum test strip

表3 弱阳性质控血清CIEP 检测结果Table 3 Results of CIEP detection in weak-positive controlled serum

3.3 田间血清敏感性检测结果

对流免疫电泳检测确认的水貂阿留申病毒抗体效价100 份田间血清倍比稀释后，对1∶8～1∶64 稀释度进行试纸条和CIEP 检测。结果显示，1∶8 稀释度下试纸条与CIEP 的阳性检出率均为100%；1∶16 稀释度下试纸条与CIEP 的阳性检出率分别为100%、90%；1∶32 稀释度下2 种方法的阳性检出率分别为99%、55%，且试纸条多显示弱阳性条带，CIEP 法检出率明显下降；1∶64 稀释度下检测时试纸条阳性检出率为96%，CIEP 法检出率仅为23%。结果见表4。

表4 不同稀释度田间血清样品试纸条检测结果Table 4 Testing results of field serum samples with different dilution

续表4

续表4

图1 弱阳性质控血清试纸条检测结果Fig.1 Testing results of weak positive property controlled serum test strip

4 讨论

水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条是用来定性检测水貂阿留申病毒抗体的快速诊断产品，其检测线（T线）的显色深浅是随水貂体内阿留申病毒抗体的含量而变化的，阿留申病毒抗体的含量高，则试纸条检测线显色深，用“++”表示显色较深的阳性结果；阿留申病毒抗体的含量低，则试纸条检测线显色浅，“+”表示显色较浅的弱阳性结果。

水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条在对不同稀释倍数的阳性质控血清进行检测时，随血清稀释倍数的增加，试纸条检测线有逐渐变浅的趋势，说明随着抗体的减少，试纸条检测能力不断下降；同样的样品用CIEP 法检测结果显示，样品未做稀释时，阳性质控血清检出率为100%，当检测经倍比稀释的阳性质控血清所制备的弱阳性样品时，CIEP的检出率随着稀释倍数的增加而下降且产生的沉淀线也变得模糊、不易判读。对田间样品检测结果再次验证了上述事实，即CIEP法对检测未经稀释的样品或稀释倍数＜1∶16 时，其阳性检出率和试纸条检测法检出率相当（检出率≥90%）；当检测样品的稀释倍数＞1∶16 时，CIEP的检测效率明显下降且检测结果不易判定，不同检测人员对结果的判读容易出现较大误差，而试纸条检测法在检测稀释度＜1∶64 的样品时，能保持较高的敏感性，其检出率＞95%。

根据上述试验中，用2 种检测方法对水貂阿留申病阳性质控血清及田间血清进行了检测，结果显示，传统的CIEP 检测方法，在对未稀释血清样品检测时，其阳性检出率与试纸条检测法的检出率一致，但随着样品稀释度的不断增加，CIEP的检测效率下降明显且结果判定难度增加，判定误差增加；试纸条检测法在对稀释度＜1∶64 的样品检测时仍有较高的检出率。

目前，在世界主要水貂养殖国家，水貂阿留申病的检测的通用方法依然是CIEP 法，在少数北欧国家，高通量ELISA 方法检测水貂阿留申病也有较广泛的应用，这些国家的水貂养殖集约化程度很高，市场成熟度方面我国与之相比还有较大差距；在我国特殊的养殖条件下，水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条有其独特的优势，它使用灵活方便，操作简便易行，结果准确可靠，对大范围普检、个体检测均可灵活应用，对比CIEP 法其优势明显，未来有望替代CIEP 法成为检测水貂阿留申病毒抗体的主流方法。