铁胁迫下感染锈腐菌的人参土壤真菌群落研究

李美佳，王秋霞，关一鸣，刘政波，孙海，潘晓曦，邵财，刘宁，张亚玉

（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

人参（Panax ginseng C.A.Mey）为五加科多年生草本植物，是我国传统名贵中药材。由锈腐菌（Cylindrocarpon destructans）引起的人参锈腐病是人参连作障碍中最主要的土传病害之一，从苗期到收获期均可发生，连作发生更为严重，甚至导致绝收，为当前生产上防治较难的主要病害之一[1-4]。而铁胁迫又是人参连作障碍中主要理化因素之一[5-6]。铁的毒害表现为铁附着在植株根部表面，进而形成红色铁斑，对植物根部造成毒害[6-8]。在植物根部土壤中，微生物群落结构及其组成变化能反映土壤的生态现状及其变化趋势，对植物健康十分重要[9]。目前，有关铁胁迫下人参锈腐病的土壤微生物群落结构变化研究鲜见报道。基于 16S rRNA 基因和ITS 序列高通量测序是一种高效、经济的现代微生物生态学工具，以此可获得高通量分析数据，进一步探明根际土壤组成，深入了解土壤细菌和真菌群落结构[10-11]。因此，本研究通过Illumina 高通量测序手段，从而揭示铁胁迫条件下人参锈腐病感染的土壤真菌群落结构多样性，为解决铁及锈腐病导致的人参连作障碍提供数据支撑。

1 材料

1.1 试验材料与试剂

2 年生健康人参苗，取自抚松县抽水参场；供试土壤采自中国农业科学院特产研究所左家自然保护区山皮土（土壤pH 7.7、全氮0.052‰、有效钾192 g/kg、速效磷13.2 mg/kg）；供试菌株人参锈腐菌（C.destrctans，中国农业科学院特产研究所药用植物栽培实验室分离鉴定并保存）；供试铁溶液（FeNaEDTA，200 mmol/L，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 孢子悬浮液制备

取培养好的菌丝块，分多点接种到PDA培养基平板上，置于28 ℃恒温培养箱中约7 d，菌丝长满全皿，将少许无菌水倒入培养皿中，用灭菌毛笔轻轻刷洗培养基表面，获得孢子悬浮液，用灭菌水制成1 106cfu/mL的分生孢子悬浮液进行接种。

2 方法

2.1 试验场地与设计

2.1.1 试验场地 试验于2018 年在中国农业科学院特产研究所温室进行。供试人参苗栽种于室温内塑料盆中。

2.1.2 实验设计 根据病菌的接种和铁的施用方法设置4 个处理：不接种锈腐病菌不加铁（CK）组；接种锈腐病菌不加铁（XF）组；不接种锈腐病菌加铁（FE）组；接种锈腐病菌加铁（FEXF）组。每个处理设3 个重复，每个重复3 盆，每盆种植5 株。

2.2 试验方法

2.2.1 锈腐菌病接种 采用针刺接种法[2]，将供试人参栽种于装土的塑料盆中，每盆种植5 株2 年生人参苗。需接种锈腐菌的处理，用浓度1 106cfu/mL 的分生孢子悬浮液进行接种，每株人参根部接种15 mL 孢子悬浮液。在接种后的第7 d 向土壤中添加浓度为200 mmol/L的FeNaEDTA溶液，放置于20/28 ℃培养，接种后的第15 d 取根际土样，将人参植株洗干净，再用蒸馏水冲洗，滤纸吸干水分，80 ℃保存备用。

2.2.2 试验管理 试验期间，各盆栽管理措施一致。盆栽人参20～28 ℃培养，红、蓝光比7∶1，试验全过程中采用称重法对所有处理均浇灌经高压蒸汽灭菌处理的蒸馏水，使得整个试验过程中不同处理间的土壤湿度均基本保持在55%～65%。

2.2.3 采样方法 样品在接种后第9 d 取根际土，同时记录发病率及发病指数。采用抖落法采集粘附在人参根系上的根际土，装入无菌袋中，每个土壤分为2份，1 份去除杂质，过2 mm筛子，并将同一处理的3 次平行混合到一起，-80 ℃保存备用。

2.3 分析测试方法

2.3.1 土壤样品总DNA提取及检测方法 选择12 份土壤样品，每个重复土样称取0.5 g，试剂盒提取土壤总DNA，送交北京百迈客生物科技有限公司构建DNA文库。采用Illumina Hiseq2 500 PE250 模式进行测序，扩增引物：采用真菌通用引物：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3', 5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'；PCR 扩增参数：95 ℃预变性 30 s；55 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 40 s，25 个循环；72 ℃延伸 7 min。

2.3.2 测序数据质量评估方法 对原始数据进行拼接[12]，将拼接得到的序列进行质量过滤[13]，并去除嵌合体[14]，得到高质量的Tags 序列。

2.3.3 操作分类单元（OTU）分析方法 在相似性97%的水平上对序列进行聚类分析[15]，以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU[16]。

2.3.4 物种注释及分类学分析 物种注释RDP Classifier[17]：置信度阈值为0.8，多重比对 PyNAST[18]；建树方法：邻接法；Alpha多样性指数分析：Qiime（1.9.1）计算 Shannon、Chao1 等多样性指数；Beta 多样性分析：多种算法呈现物种多样性矩阵。

3 结果与分析

3.1 铁对人参锈腐病感染下的真菌群落组成影响与多样性分析

在测序数据统计后，从12 个样品中获得总共819 101个有效标签，主要分为8 个已知真菌门、135 个已知真菌属。如图1 所示，随着测序量的不断增大，各样品OTU 数目增加趋于平缓，达到饱和，说明测序数据量能够真实地反映土壤样本的真菌群落。样本文库的覆盖率指数均在99.9%以上，反映此次测序结果代表了样本中真菌种群的真实情况。各样品的菌群丰度指数（Chao 1、Ace）、生物多样性指数（Shannon、Simpson）表明，采集的土壤样品中真菌菌种群多样性较高（表1）。分析表明，在97%相似度水平下，XF 组与CK 组，FE 组与FEXF 组样品之间的OTU 数目差异不显著，FEXF 组与CK 组样品之间的OTU 数目呈显著差异。

表1 不同处理中真菌群落多样性指数Table 1 Diversity index of fungal community in different samples

图1 不同处理土壤真菌的稀释曲线Fig.1 Dilution curves of fungal community in different samples

不同样品中真菌在纲水平的相对丰度见图2。对图2 分析发现，不同土壤样本真菌在群落组成和丰度上存在差异，对照组根际土壤的优势类群为Leotiomycetes 纲；锈腐菌感染组根际土壤优势类群为Sordariomycetes纲；铁胁迫组根际土壤优势类群为Orbiliomycetes 纲；铁胁迫和锈腐菌感染组土壤中所共有的优势类群为Mortierellom-ycetes 纲。

图2 不同样品中真菌在纲水平的相对丰度Fig.2 Relative abundance of different fungal in different samples in class level

3.2 不同样品中真菌群落结构的多样性分析

根据12 个土壤样品中细菌OTU 类型的丰度值，利用非度量多维尺度法（NMDS）进行多样性分析，比较不同样品在真菌组成上的差异。在应力值=0.03 水平上，不同土壤中的真菌菌群受铁和锈腐菌同时胁迫的差异影响最大（图3），单独铁胁迫或者锈腐菌胁迫与对照组的距离相似，是相互独立的，距离较近。表明同时进行铁和锈腐菌胁迫对土壤中真菌菌群造成明显影响。

图3 不同样品中真菌群落多样性的NMDS 分析Fig.3 NMDS analysis of bacteria community diversity

3.3 不同样品中真菌群落结果的聚类分析

对12 个样品基于 Beta 多样性分析得到距离矩阵，通过非加权组平均法（UPGMA）进行层次聚类分析（图4）。同时有铁及锈腐菌胁迫的土壤样品均单独归为一支，其中，对照组的土壤样品与铁胁迫、锈腐菌感染的土壤样品归为一个大的分支，在物种组成上对照土壤样品与铁胁迫土壤样品较锈腐菌感染土壤更近。该结果与NMDS 分析结果一致，充分说明同时进行铁胁迫和锈腐菌感染影响明显。

图4 不同样品中真菌群落组成的层次聚类分析Fig.4 Hierarchical cluster analysis of fungal community composition in different samples.

4 结论与讨论

本研究旨在分析铁胁迫和锈腐病感染对人参根际土壤中微生物菌落的结构影响，探究人参连作障碍的关键因素，为利用微生态调控措施防控人参连作障碍提供理论依据，同时为探索土壤中存在的锈腐病菌拮抗微生物提供了新的线索。人参锈腐病发病初期侵染处出现锈色斑点，由浅入深，从表皮至根髓扩散，逐渐扩大为锈褐色病斑，发病严重时病菌深入根内组织，病斑扩散至侧根乃至全根，最终地下参根腐烂，危害极大[19-20]。本研究采用Illumina Hiseq2 500 高通量测序技术对铁胁迫及锈腐菌感染的土壤真菌群落组成进行对比分析发现，铁胁迫及锈腐菌感染的人参根际土壤真菌组成丰富，结构组成及相对丰度存在一定差异。通过对不同土壤样品进行NMDS和层次聚类分析分析结果表明，同时进行铁胁迫及锈腐菌感染会使土壤种群结构变化显著；在纲水平，同时进行铁胁迫及锈腐菌的真菌中锈腐菌属于的 Sordariomycetes 纲相对丰度减少，Mortierellomycetes 纲显著升高。铁的施加没有提高锈腐病的感染数量，而是通过改变真菌群落提高了其他真菌（Mortierellomycetes）的数量。