伤科消肿止痛膏制备工艺以及有效成分含量测定

章洪，王萧枫，黄淑娴

（温州市中西医结合医院，浙江 温州 325000，1.药剂科；2.骨科）

伤科消肿止痛膏为温州市中西医结合医院传统的伤科外用药，由大血藤、鸡血藤、红木香等7味中草药组成，是老一辈骨伤名家在民间秘方基础上的集体经验结晶[1]，至今已有40 多年的使用历史，临床疗效显著[2]，尤其是对各种筋伤有显著的消肿止痛功效，在温州乃至浙南地区享负盛名。研究表明，伤科消肿止痛膏对急性软组织损伤有确切的疗效[2]，其抗炎镇痛的作用明显优于伤科灵[3]，其活血化瘀消肿方面优于扶他林软膏[4-5]。然而其工艺粗糙，制备周期长，难以对药效成分和主要成分进行有效的质控。本研究采用正交法对影响中药提取的4个因素进行考察，采用单因素考察法选取合适辅料，并采用HPLC法测定虎杖苷和大黄素的含量。

1 材料和方法

1.1 仪器 Milli-Q型超纯水系统（美国Millipore公司）；Agilent 1200型高效液相色谱仪，配制四元梯度泵、在线脱气机、DAD检测器（美国安捷伦公司）；RE-5205旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DTY-10A智能恒温循环器（北京德天佑科技发展有限公司）；101-AB型电热鼓风干燥箱、DZF6050AB真空干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；JCS-600电子天平（金华凯丰集团有限公司）；CP214电子天平（美国奥豪斯仪器有限公司）；S10-3型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂 虎杖苷对照品（批号DS170309-038，纯度98%，成都德思特生物技术有限公司），大黄素对照品（批号DST161212-030，纯度98%，成都德思特生物技术有限公司），明胶（批号2091044，江门罗赛洛明胶有限公司），阿拉伯胶（批号170301，鄂州葛店人福药用辅料有限公司），甘油（批号20170801，南昌白云药业有限公司），苯甲酸钠（批号20170309，长沙华日制药有限公司），月桂氮卓酮（批号170202，天门科捷制药有限公司），乙腈、甲醇（色谱纯）；其他试剂均为分析纯。鸡血藤（批号161201，产地浙江）、大血藤（批号170101，产地浙江）、红木香（批号160920，产地云南）、虎杖（批号161101，产地浙江）、栀子根（批号160901，产地浙江）购自浙江中医药大学中药饮片有限公司；生川乌（批号160719，产地四川）、生草乌（批号160701，产地浙江）购自杭州华东中药饮片有限公司；饮片均由温州市中西医结合医院中药房提供。

1.3 提取工艺

1.3.1 醇提工艺：取鸡血藤、大血藤、虎杖、栀子根和红木香五味药，在进行了单因素考察的前提下，采用L9（34）正交表安排试验，以溶剂用量（A）、提取时间（B）、乙醇浓度（C）、提取次数（D）为影响因素，选用虎杖苷、大黄素和干膏的得率的综合评分为指标，进行条件优选，因素及水平见表1。

表1 L9(34)因素水平表

1.3.2 水提工艺：取生川乌和生草乌适量，加入7倍量的水，提取2次，每次2 h，合并提取液，过滤，浓缩至相对密度1.03（50 ℃），备用。将醇提液与水提液混合，即得伤科消肿止痛膏提取液。

1.4 制备工艺

1.4.1 制备：取明胶和阿拉伯胶加入伤科消肿止痛膏提取液适量，水浴60 ℃溶解，搅拌均匀，再加入苯甲酸钠和甘油适量，搅拌均匀，当水浴温度降至40 ℃时，加入氮酮，搅拌均匀，涂布在无纺布上，待其冷却凝固即得伤科消肿止痛膏。

1.4.2 单因素考察：采用单因素考察法，分别考察明胶与阿拉伯胶的比例（1:1、4:1、1:4）和伤科消肿止痛膏提取液的加入量（10、15、20 mL）。

1.5 含量测定

1.5.1 色谱条件：大黄素采用色谱柱为Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相0.1%磷酸水溶液-甲醇（20:80）；流速1.0 mL·min-1；检测波长254 nm；柱温25 ℃；进样体积10 μL。

虎杖苷采用色谱柱为Agilent TC-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，15% B；10～30 min，15%～30% B）；流速1.0 mL·min-1；检测波长306 nm；柱温25 ℃；进样体积10 μL。

1.5.2 对照品溶液的制备：精密称取大黄素对照品适量，加甲醇定容，即得大黄素对照品溶液。精密称取虎杖苷对照品适量，加稀乙醇定容，即得虎杖苷对照品溶液。

1.5.3 供试品溶液的制备：取伤科消肿止痛膏适量，去除无纺布，精密称定，精密加入三氯甲烷 25 mL和2.5 mol·L-1硫酸溶液20 mL，称量，置80 ℃ 水浴中加热回流2 h，冷却至室温，再称定重量，用三氯甲烷补足减失重量，摇匀。分取三氯甲烷液，精密量取10 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得大黄素供试品溶液。

取伤科消肿止痛膏适量，去除无纺布，精密称定，精密加入稀乙醇25 mL，称定重量，加热回流 30 min，冷却至室温，再称定重量，用稀乙醇补足减失重量，摇匀，取上清液，滤过，取续滤液，即得虎杖苷供试品溶液。

1.5.4 阴性溶液的制备：按提取工艺和制备工艺制备不含虎杖的伤科消肿止痛膏，按供试品溶液制备方法分别制备大黄素阴性溶液和虎杖苷阴性溶液。

1.5.5 专属性考察：吸取对照品溶液、供试品溶 液、阴性溶液适量，运用本研究色谱条件进样测定。

1.5.6 线性关系考察：精密吸取虎杖苷和大黄素对照品溶液适量，稀释成一系列质量浓度的对照品溶液（虎杖苷：0.006、0.020、0.059、0.178、0.533、1.600 mg·mL-1；大黄素：0.014、0.041、0.123、 0.370、0.740 mg·mL-1）。运用本研究色谱条件对虎杖苷和大黄素进行检测。

1.5.7 精密度试验：精密吸取同一供试品溶液，运用本文色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。

1.5.8 稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，运用本文色谱条件分别在0、2、4、8、16、24 h进样测定，记录峰面积。

1.5.9 重复性试验：精密吸取同一批供试品溶液，6份，运用本研究色谱条件进样测定，记录峰面积。

1.5.10 加样回收试验：取伤科消肿止痛膏适量12份，去除无纺布，精密称定，分别加入大黄素和虎杖苷对照品适量，按1.5.3 项供试品溶液制备方法制备，进样测定，记录峰面积。

2 结果

2.1 提取工艺 按处方量称取各药材适量，按正交设计表所列条件回流提取，测定虎杖苷和大黄素的得率以及干膏得率，并计算。结果=干膏得率/最大干膏得率×20+虎杖苷得率/最大虎杖苷得率×40+大黄素得率/最大大黄素得率×40。

直观分析IA＞IIA＞IIIA，IIIB＞IIB＞IB，IIC＞ IC＞IIIC，IIID＞IID＞ID，RD＞RC＞RB＞RA。方差分析 A为误差项，B、C、D对指标的影响差异无统计学意义，见表2-3。所以最佳醇提工艺为D3C2B3A1，考虑到节约时间和成本，故最终最佳醇提工艺为 D3C2B2A1，即7倍体积的70%乙醇溶液，提取3次，每次2 h。

确定提取工艺为：鸡血藤等五味药用7倍体积的70%乙醇溶液，提取3次，每次2 h，合并提取液，过滤，回收乙醇，浓缩至相对密度为1.03（50 ℃）；生川乌和生草乌用7倍量的水，提取2次，每次2 h，合并提取液，过滤，浓缩至相对密度1.03（50 ℃）。合并醇提液与水提液即得伤科消肿止痛膏提取液。

表2 正交试验结果

表3 方差分析

2.2 制备工艺 由表4可知，明胶与阿拉伯胶的比例为1:4，两者质量总和与伤科消肿止痛膏提取液的比例为1:3时，所得膏体内外黏度适中。

确定制备工艺为以1:4的比例取明胶和阿拉伯胶适量，混合均匀，加入3倍量伤科消肿止痛膏提取液，水浴60 ℃溶解，搅拌均匀，再加入苯甲酸钠和甘油适量，搅拌均匀，当水浴温度降至40 ℃时，加入氮酮适量，搅拌均匀，涂布在无纺布上，待其冷却凝固即得伤科消肿止痛膏。

表4 制备工艺

2.3 含量测定

2.3.1 专属性考察：在本研究色谱条件下，2种成分均能基线分离，供试品中虎杖苷和大黄素的保留时间与对照品中色谱峰的保留时间相符，在阴性溶液中均无干扰峰（见图1-2）。

2.3.2 线性范围：以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，得到线性回归方程：虎杖苷Y=20164X- 39.865（r=0.9999），在0.006～1.600 mg·mL-1线性关系良好；大黄素Y=20394X-4.5931（r=0.9996），在0.014～0.740 mg·mL-1线性关系良好。

2.3.3 精密度、稳定性、重复性和加样回收实验：连续进样6次，虎杖苷的RSD为0.870%，大黄素的RSD为0.851%，表明仪器精密度良好。室温下放置24 h，虎杖苷的RSD为0.786%，大黄素的RSD为0.719%，表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。同一批样品进样检测，虎杖苷的RSD为2.154%，大黄素的RSD为2.811%，表明本方法重复性良好。虎杖苷和大黄素加样回收率在（100±5）%以内，符合要求，见表5。

2.3.4 工艺验证：按处方配比取各药材共650 g，按提取工艺和制备工艺制备伤科消肿止痛膏3批，虎 杖苷的得率分别是2.30%、2.34%、2.20%，RSD值为3.085%；大黄素的得率分别是0.72%、0.86%、0.76%，RSD值为9.415%；平均每克含虎杖苷12.71 μg，含大黄素4.14 μg。符合要求，该工艺可用于大批量制备。

3 讨论

3.1 指标成分的选择 处方中虎杖的质量标准完整，其主要药效成分大黄素和虎杖苷均有完整的定性定量检测手段[7-8]。大黄素具有抑菌抗炎及免疫调节抗氧化等作用，对多种血管有舒张作用，能改善微循环，抑制血小板聚集，降低血液黏度[9-10]；虎杖苷具有抗菌抗病毒抗炎抗过敏的作用，对血管内皮细胞结构和功能的完整性有着重要作用，从而维持血管通透性、免疫防御以及炎症反应[11-12]。研究之初，也考虑过红景天苷和芒柄花素作为检测成分，但在预试验中发现，红景天苷难以有效分离，芒柄花素含量太低，故舍弃，最终选择大黄素和虎杖苷作为指标成分。

图1 虎杖苷高效液相色谱图

图2 大黄素高效液相色谱图

表5 加样回收率

干膏是中药提取物的药效物质基础，干膏的得率的大小对有效成分的得率和制剂临床疗效有着一定的影响，在醇提工艺的正交试验中，确定干膏得率、大黄素得率、虎杖苷得率的权重系数为20:40:40。实验以2个药效成分和干膏得率为指标成分对醇提工艺进行综合评价，符合中药复方的整体观。

3.2 正交实验水平选择 实验之初，采用单因素法分别考察了乙醇浓度和提取次数对药效成分得率的影响，研究发现，70%乙醇对2种药效成分都具有较好的提取效果，故选择50%、70%、90%作为乙醇 浓度的3个水平。研究还发现，经过3次提取，大黄素已难以检测，虎杖苷峰面积下降了14倍，可忽略不计，故选择1次、2次、3次作为提取次数的3个水 平。

3.3 大黄素转移率 按药典方法测定同批次虎杖药材中大黄素的含量为20.4%，五味药材合煎后，大黄素的得率仅0.611%，转移率仅3.00%，说明在提取过程中大部分大黄素转化为其他成分，具体转化为何种成分，有待进一步实验。

本研究建立的伤科消肿止痛膏制备工艺，操作简单，过程可控，对提高伤科消肿止痛膏药效的稳定性有一定的作用，可用于大批量生产。