烟草病毒病检测方法的研究现状

摘  要：目前针对烟草花叶病毒病、烟草黄瓜花叶病毒病、马铃薯Y病毒病的检测方法主要有指示植物法、电镜诊断法、血清学检测法、核酸分子杂交技术、以PCR为基础的分子生物学技术等，通过阐述这些检测方法的原理，分析其优势及不足，为烟草病毒病检测技术的发展提供科学依据及理论参考。

关键词：烟草病毒病;检测方法;研究现状

中图分类号：S435          文献标志码：A         文章编号：2095-2945（2019）35-0140-02

Abstract： At present，the detection methods of tobacco mosaic virus（TMV）， cucumber mosaic virus（CMV） and potato virus Y （PVY） are mainly about plant method， electronmicroscopy， serological detection， nucleic acid molecular hybridization， molecularbiology technology based on PCR， etc. By expounding the principles of these detection methods and analyzing their advantages and disadvantages， this paper provides scientific basis and theoretical reference for the development of tobacco virus disease detection technology.

Keywords： tobacco virus; detection methods; research status

煙草病毒病种类多、分布广，是我国烟区的重要病害之一。二十世纪五十年代以后，烟草病毒病先后在世界各地发生危害并暴发性流行，给烟草生产造成了重大损失。目前，世界烟草病毒种类达47种，常见的有20余种，我国在烟草上已发现的病毒有17种，其中危害较严重，发生较普遍的主要是烟草花叶病毒（TMV）、烟草黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯Y病毒（PVY）等3种病毒。针对这三种病毒的检测方法主要有指示植物法、电镜诊断法、血清学检测法、核酸分子杂交技术、以PCR为基础的分子生物学技术等。

1 指示植物法

该方法是将对某种病毒有专化性反应的植物作为指示植物，根据病毒侵染指示植物后表现的症状，鉴别病毒的存在与否及种类。作为指示植物其最大的特点就是对某一种或几种病毒特别敏感，并且呈现明显的外表症状，例如在洋酸浆上接种PVY叶片出现小枯斑。在病毒含量较少的情况下，被侵染的植物本身症状表现不出来或在体内表现为潜伏状态时，在指示植物上可表现出明显的外部症状。这种鉴定病毒的方法操作简单、准确度高，但检测速度慢、费用高，特异性差，存在一病多症、多病一症的现象。

2 电子显微技术

自1940年Kausche和Melcher首次在电镜下观察到TMV以来，电镜已成为植物病毒研究的常规手段之一。常见的电子显微技术有负染色法、超薄切片和免疫电镜等，这些技术可以直观地反映病毒粒子的形态结构、在寄生细胞内的存在状态、病毒的复制和装配、以及寄主细胞的结构变化等过程。Edwardson等总结了各种植物病毒的形态学和细胞病理学特征，认为一般情况下运用负染色法和超薄切片电镜观察就能够诊断和鉴别出植物病毒，通常可诊断到组水平，根据有些细胞的病变特征还能鉴别到病毒的种甚至株系。电子显微镜技术可以直接观察到病毒的存在与否和形态结构，可以说是最直接，最准确的检测病毒的手段。

3 血清学检测方法

血清反应又叫免疫反应，是指抗体与抗原的特异性结合使抗原失去活力的反应。利用血清反应可以检测病毒的存在与否。常用的血清学检测方法有酶联免疫吸附法、点免疫结合测定技术和电化学酶联免疫检测技术等。

3.1 酶联免疫吸附法（ELISA）

目前，ELISA是植物病毒检测过程中最常用的方法之一。该方法的原理是将抗原或抗体吸附在固体支持相上，用酶标记抗原或抗体，定性或定量的检测相应的抗体或抗原。Voller和Clark等于1976年首次将ELISA引入植物病毒检测，目前已形成多种检测方法，常用的方法有6种：直接法、间接法、竞争法、酶抗酶法、双夹心法及双抗体夹心法等，其中应用最广的是间接法和双抗体夹心法。常用的抗体是多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体制备简单，应用广泛，而单克隆抗体制备过程较复杂，但专化性强，在低浓度病毒的鉴定和病毒株系的鉴定方面有突出优势。ELISA克服了常规血清学方法在病毒检测过程中的局限性，具有特异性强，灵敏度高，稳定简便等优点。

3.2 点免疫结合测定技术（DIBA）

DIBA又叫组织印迹法，是在ELISA的基础上发展起来的植物病毒检测技术。该方法用硝酸纤维素膜（NCM）替代酶联板，在简化操作程序的同时，保持了灵敏度高，特异性强的特点，病毒检测过程更快速、简便。DIBA可采用直接或间接ELISA进行植物病毒检测，通常间接ELISA的灵敏度比直接ELISA高。

3.3 电化学酶联免疫检测（ECEIA）

ECEIA是将电化学分析法与酶免疫分析法相结合的一种新的检测方法，该方法结合了电化学分析法的高灵敏度和酶免疫分析法的高特异性，它是以酶标抗原催化电活性产物的产生为基础的检测方法。电化学反应发生在电极或液体的表面，该反应检测分析的信号只与被检测物表面的浓度相关，因此该方法适用于检测少量样品。ECEIA主要包括安培酶联免疫分析法和伏安酶联免疫分析法2种技术，用于植物病毒检测的主要是伏安酶联免疫分析法。ECEIA灵敏度高、准确性好、操作简单，目前已成功研制出多种病毒的检测试剂盒。

4 核酸分子杂交技术

杂交是指核苷酸序列通过碱基互補配对形成稳定的杂合双链的过程。杂交双方分别是使用的探针和待检测的核酸。常见的核酸杂交技术包括：

（1）Southern杂交。DNA片段电泳后从琼脂糖凝胶中转印到NCM或尼龙膜上，然后进行探针杂交，被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。

（2）Northern杂交。该方法与Southern杂交很相似，RNA片段电泳后，将RNA转印到NCM上，然后与探针杂交，主要区别在于Northern杂交的被检测对象是RNA。为了除去RNA中的二级结构，保证RNA按分子大小进行分离，一般用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性。

（3）点杂交。点杂交是杂交信号呈现斑点样的杂交方法，将DNA或RNA样品直接点在NCM或尼龙膜上与探针分子杂交。对于DNA或RNA，该方法操作简单结果直观，适用于大批样品的检测。

5 分子生物学技术

聚合酶链式反应（PCR）被广泛地应用于生物学、遗传学及遗传工程等领域。PCR技术在植物病毒的检测领域方面具有特异性强、灵敏度高、高效准确等优势。基于PCR技术又衍生出一些新的检测技术，为植物病毒的检测提供了便捷。

（1）RT-PCR。反转录PCR（RT-PCR）是一种常用的植物病毒检测技术。该方法是以待检测的病毒RNA为模板进行反转录合成cDNA，再以cDNA为模板在PCR仪上进行扩增，一种病毒的不同株系可以利用不同引物来区分。RT-PCR检测技术超越了血清学方法，为病毒检测提供了更专一、准确的手段，在病毒检测方面应用广泛。

（2）实时荧光RT-PCR。实时荧光RT-PCR是将RT-PCR与荧光技术相结合的检测手段，利用荧光染料或荧光标记的探针与PCR扩增产物相结合，在扩增的每一次循环中都可以观察到荧光强度的变化，这种变化反映扩增产物量的增减，最终通过绘制标准曲线得到反应初期的靶基因数量。与常规RT-PCR相比，实时荧光RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、测定偏差小等特点。

（3）免疫捕捉PCR技术（IC-RT-PCR）。免疫捕捉PCR技术是指在进行RT-PCR扩增反应之前，利用抗原抗体特异性结合的原理将待测病毒固定在微管或微板上，通过洗涤、洗脱处理富集病毒，之后再进行RT-PCR反应。该方法不仅避免了常规RT-PCR检测过程中对核酸样品制备的损失和破坏，而且提高了反应的灵敏度。Wetzel等首次利用IC-RT-PCR技术检测李痘病毒。

6 等温环介导技术（LAMP）

LAMP是日本学者Notomi等于2000年研发的一种新的核酸扩增技术。该技术针对目的基因的6个区域设计出4条特异性引物进行扩增，在恒温条件下依赖链置换反应在DNA聚合酶的催化下进行扩增，无需像PCR一样经过变性、退火和延伸三个过程。检测LAMP产物的方法有多种，对产物进行电泳可观察到梯状条带，在产物中加入荧光染料，在紫外灯下会发出绿色荧光。在LAMP扩增过程中，dNTPs析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg+结合会产生焦磷酸镁盐白色沉淀，可通过肉眼观察到。该技术具有的灵敏度高、特异性强、成本低等特点。

以上六种方法是目前针对烟草病毒病的检测方法，但仍存在一些弊端。血清学检测方法特异性差，容易受外界因素影响，检测过程花费时间长，并且抗体价格较高;传统的分子生物学方法需要提取植物总RNA，在提取过程中RNA易降解，且提取时间长，成本高;等温环介导技术容易产生假阳性，产物易污染。

目前，就如何高效、快速、低成本地检测烟草病毒，许多研究员探索了一些快速检测烟草病毒的方法体系，刘勇等利用组织印迹法检测到了烟草TMV和CMV，该方法操作简便，但只适用于检测新鲜样品，对于冷冻保存的样品检测结果容易受印迹后留下的褐色斑干扰;于翠等利用IC-RT-PCR检测到了CMV，该方法省去了提取核酸的步骤，但抗体包被、洗脱处理等步骤所需时间较长;代园凤等利用烟草叶片的浸提液，以PVDF膜为吸附膜，结合RT-PCR检测到了烟草PVY，该方法虽然省去抽提核酸的步骤，加快了检测速度，但体系不太稳定，仍需进一步优化。关于烟草病毒病的检测方法是一个长期、持续性的研究方向，需要不断的尝试、探索，为更快、更准确、成本更低、适用性更广的检测技术奠定基础。

参考文献：

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