平突散系列复方对CD40L刺激后人球后成纤维细胞的MMP和TIMP表达的影响

万红，陈亚琳，崔亚萍，余丹丹，燕树勋，3*

甲状腺相关性眼病（TAO）是一种危及视力且损伤眼部器官的自身免疫性疾病［1］，其主要病变部位在眼眶结缔组织及眼外肌，临床表现为眼球前突、复视、斜视、暴露性角膜炎和压迫性视神经病变等眼部器官损伤及视力下降，甚至失明，严重者需摘除眼球［2-3］。TAO的治疗是业界公认的难题，治疗手段有一般支持治疗（如戒烟）、药物治疗（如糖皮质激素、免疫抑制剂等）、眼眶放射治疗、手术治疗，目前只能达到缓解眼部不适的目的且不良反应较多［4］。

中医药在改善TAO临床症状方面有独特的优势，但是作用机制一直不清楚。部分研究发现雷公藤甲素、夏枯草、浙贝提取物以及中药复方能够通过抑制人球后成纤维细胞（RFs）的增殖；抑制透明质酸（HA）和胶原的合成；抑制干扰素（IFN）-γ刺激后细胞间黏附分子（ICAM）-1、HLA-DR、CD40的过度表达等途径，发挥其治疗作用［5-11］。

本研究旨在观察CD40L干预体外培养的RFs，建立TAO实验模型，观察泻火平突散、活血平突散、养目平突散含药血清对基质金属蛋白酶（MMP）、MMP组织抑制剂（TIMP）表达的影响，进而进一步探讨平突散系列复方治疗TAO的可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 中药颗粒剂的制备 中药复方颗粒剂购于四川新绿色药业科技发展股份有限公司，并由河南中医药大学第一附属医院中药制剂室制备成3 g/ml口服液。泻火平突散药物组成：龙胆草 15 g、菊花 10 g、夏枯草 30 g、栀子 15 g、黄芩 15 g、青黛 15 g、黄药子 9 g、牡丹皮 15 g、赤芍 12 g、青葙子 15 g、白蒺藜15 g。活血平突散药物组成：赤芍15 g、山慈菇20 g、穿山甲 9 g、泽兰 15 g、生牡蛎 15 g、三棱 15 g、莪术 15 g、玄参 20 g、浙贝 15 g、黄药子 9 g、鳖甲 10 g、泽泻 15 g。养目平突散药物组成：旱莲草30 g、女贞子30 g、熟地20 g、玄参 20 g、丹皮 20 g、白芍 15 g、鳖甲 10 g、浙贝 15 g、茺蔚子20 g、莪术 15 g、白芥子 20 g、牡蛎 15 g。

1.2 动物实验分组与含药血清的制备 2016年9月选取35只SPF级SD雄性大鼠，体质量250～300 g。由河南省实验动物中心供给，动物合格证号：0001611，许可证号：SCXK（豫）2016-011。大鼠按体质量分层随机分为对照组、A组（给予泻火平突散）、B组（给予养目平突散）、C组（给予活血平突散）。其中对照组5只，其余每组各10只。4组均给予标准饲料喂养3 d后，按照人体表面积换算60 g·kg-1·d-1灌胃给药（对照组给予超纯水灌胃），每天根据大鼠体质量的不同调整给药量，3次/d，连续灌胃3 d。其中A、C组各死亡1只大鼠。其余大鼠于最后一次给药1 h后，以0.4 ml/100 g剂量将4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，无菌下腔静脉采血。血清于4 ℃冰箱内放置3 h后离心、取上清液、灭活，-70 ℃冰箱冻存备用。

1.3 RFs的培养 本研究中所用的人RFs来源于2例眼创伤患者（2014年取材于郑州大学第一附属医院眼科），1例为创伤性白内障（男，4岁），另外1例为双眼晶状体半脱位（男，6岁），均征得其家属同意。按照文献［11］进行细胞培养，成功复苏体外培养的RFs，在光镜下观察可见细胞形状为梭形和多角形，2～3 d后细胞平铺覆盖瓶壁面积的80%～90%。细胞鉴定的免疫细胞化学染色结果为纤维原细胞的标记细胞波形蛋白（vimentin）为阳性，细胞角蛋白（cytokeration）为阴性，判定为RFs［5］。实验所用细胞为2～5代细胞，细胞形态和性能在各代间均无显著差异。

1.4 实验分组以及免疫细胞化学染色法检测MMP-1、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2的表达 实验分组如下，空白组：给予正常培养液；血清组：给予含10%正常大鼠血清的培养液；CD40L组：给予含 100 ng/ml CD40L的培养液；CD40L+血清组：给予含100 ng/ml CD40L和10%正常大鼠血清的培养液；泻火平突散组：给予含有100 ng/ml CD40L和10%含药血清的培养液；活血平突散组：给予含有100 ng/ml CD40L与10%含药血清的培养液；养目平突散组：给予含有100ng/ml CD40L与10%含药血清的培养液。免疫细胞化学染色法检测各组MMP-1、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2在RFs中表达的平均光密度值［12］。实验独立重复6次。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理。计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫细胞化学染色法检测各组MMP-1、MMP-2的表达CD40L组MMP-1活性低于空白组、CD40L+血清组MMP-1活性低于血清组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泻火平突散、活血平突散、养目平突散组MMP-1高于CD40L+血清组，差异有统计学意义（P＜0.05）；养目平突散组MMP-1活性高于泻火平突散组、活血平突散组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组和血清组MMP-1活性、CD40L组和CD40L+血清组MMP-1活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

CD40L组MMP-2活性低于空白组、CD40L+血清组MMP-2活性低于血清组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泻火平突散、活血平突散、养目平突散组MMP-2活性高于CD40L+血清组，差异有统计学意义（P＜0.05）；养目平突散组MMP-2活性高于泻火平突散组、活血平突散组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组和血清组MMP-2活性、CD40L组和CD40L+血清组MMP-2活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

2.2 免疫细胞化学染色法检测各组TIMP-1、TIMP-2的表达 CD40L组TIMP-1活性高于空白组、CD40L+血清组TIMP-1活性高于血清组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泻火平突散、活血平突散、养目平突散组TIMP-1活性低于CD40L+血清组，差异有统计学意义（P＜0.05）；养目平突散组TIMP-1活性低于泻火平突散组、活血平突散组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组和血清组TIMP-1活性、CD40L组和CD40L+血清组TIMP-1活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。

CD40L组TIMP-2活性高于空白组、CD40L+血清组TIMP-2活性高于血清组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泻火平突散、活血平突散、养目平突散组TIMP-2活性低于CD40L+血清组，差异有统计学意义（P＜0.01）；养目平突散组TIMP-2活性低于泻火平突散组、活血平突散组，差异有统计学意义（P＜0.01）；空白组和血清组TIMP-2活性、CD40L组和CD40L+血清组TIMP-2活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。

表2 各组TIMP-1、TIMP-2比较（x±s，n=6）Table 2 Comparison of mean expression levels of TIMP-1 and TIMP-2 in seven groups

2.3 各组MMP-1/TIMP-1、MMP-2/TIMP-2比较 CD40L组MMP-1/TIMP-1低于空白组、CD40L+血清组MMP-1/TIMP-1低于血清组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泻火平突散、活血平突散、养目平突散组MMP-1/TIMP-1活性高于CD40L+血清组，差异有统计学意义（P＜0.05）；养目平突散组MMP-1/TIMP-1高于泻火平突散组、活血平突散组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组和血清组MMP-1/TIMP-1、CD40L组和CD40L+血清组MMP-1/TIMP-1比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

CD40L组MMP-2/TIMP-2低于空白组、CD40L+血清组MMP-2/TIMP-2低于血清组，差异有统计学意义（P＜0.05）；泻火平突散、活血平突散、养目平突散组MMP-2/TIMP-2高于CD40L+血清组，差异有统计学意义（P＜0.05）；养目平突散组MMP-2/TIMP-2高于泻火平突散组、活血平突散组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组和血清组MMP-2/TIMP-2、CD40L组和CD40L+血清组MMP-2/TIMP-2比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表3）。

表3 各组MMP-1/TIMP-1、MMP-2/TIMP-2比较（x±s，n=6）Table 3 Comparison of mean ratio of MMP-1/TIMP-1，MMP-2/TIMP-2 in seven groups

3 讨论

3.1 现代医学对TAO的认识 TAO是一种自体免疫性疾病，且具有一定程度的器官特异性，特异性组织学变化是眼球后组织大量淋巴细胞浸润、糖氨多糖和胶原蛋白的沉积及球后组织纤维化。TAO确切的发病机制尚不清楚，而目前有研究证实，在TAO发展过程中，RFs作为效应细胞和靶细胞，在眼眶组织免疫反应、炎性反应、脂肪细胞的分化和增殖及细胞外基质（ECM）方面起了重要作用［13］。

研究证实在TAO患者RFs上存在CD40的异常表达，当RFs将球后的自身抗原提呈给转运至眼球后的T细胞形成HLA-TCR复合物时，T细胞表面的CD40L与RFs上的CD40结合，使RFs活化并上调多种协同刺激分子的表达，在双信号的作用下，T细胞被激活为针对自身抗原的杀伤性T细胞，分泌多种细胞因子，诱发自身免疫反应；RFs通过表达CD40分子，并且与CD40L结合而被激活，激活后主要促进透明质酸（HA）的合成、前列腺素E2（PGE2）的生成此外CD40L能上调IL-1α的合成，刺激RFs增生和氨基多糖合成［14-16］。故CD40-CD40L代表着一个重要的成纤维细胞活化通路，是GO的分子致病基础，阻断CD40-CD40L途径可能是治疗TAO的一个新方向。

ECM的沉积作为TAO的重要病理表现，能够引起球后组织的水肿，导致患者出现复视、斜视甚至压迫视神经导致失明。作为能够水解ECM的蛋白裂解酶，MMP的主要功能是降解ECM，从而在组织重建和修复等过程中发挥重要作用。在正常的生理条件下，MMP和TIMP相互配合，保持着ECM降解和重塑的平衡。但当发生病理改变时，这种平衡状态被破坏，进一步引起组织病理学的改变。有研究表明，MMP/TIMP失衡表现为MMP表达下降，而TIMP表达上调从而致使眶后组织ECM降解不足而积聚过多，这也正是造成眼球突出的重要因素之一［17］。

3.2 中医对TAO的认识 古籍中对TAO描述为“目如火赤，绽大胀于睥间，不能敛运转动……，犹鹘鸟之珠”，故称之为“鹘眼凝珠”［18］。病因病机可归纳为情志内伤，肝郁化火，上犯于目，使目眶脉络涩滞所致；素体阴虚，或邪热亢盛，日久伤阴，或劳伤过度，耗伤阴血，心血亏虚，肝阴受损，阴虚阳亢，上犯目窍；七情内伤，肝失疏泄，肝木乘脾，脾失健运，气机阻滞，血性不畅为瘀，津液凝聚为痰，痰瘀互结，阻于眶内。因其病理特点是本虚标实、虚实兼杂，故临床证型多变。常见证型有肝郁脾虚、肝郁火旺、痰瘀互结、气阴两虚、肝肾阴虚型等，常采用疏肝健脾、清肝泻火、化痰散瘀、益气养阴、滋补肝肾之法，常用方剂有逍遥散、参苓白术散、龙胆泻肝汤、双合汤、生脉饮、杞菊地黄丸、石斛夜光丸，以及针刺疗法［19-21］。

3.3 平突散系列复方治疗TAO分析 燕树勋教授根据TAO目前西医研究机制及中医病因病机，结合自己多年的临床经验，认为RFs细胞因子表型可能与中医证型呈对应关系：即早期细胞因子表现为Th1型细胞因子，中医辨证为标实，以肝火旺盛为主，痰瘀互结为辅，以清肝泻火为法，佐加活血化痰之药，泻火平突散治之。中期以Th0型细胞因子为主，中医辨证为由标实向本虚过度，以标实为主，为痰瘀互结证，以化痰散瘀为法，活血平突散治之。晚期细胞因子表现为Th2时，中医辨证为本虚标实，以本虚为主，为肝肾阴虚证，痰瘀互结，以滋肝益肾、化痰祛瘀为法，养目平突散治之。

泻火平突散中龙胆草味苦，性寒，归肝、胆经，有清泻肝胆实火之功，夏枯草为清肝火、散郁结的要药，二者共奏清泻肝经实火之功而为君药。黄芩有清热燥湿，解毒功效；青黛清热解毒，凉血；青葙子清肝明目，退翳；菊花发散风热，清肝明目，平抑肝阳；白蒺藜平肝疏肝，祛风明目。这五味药既能助君药清肝火之功，又有明目之效，共为臣药。黄药子解毒消肿、化痰散结消瘿、凉血止血；栀子凉血解毒；赤芍清热凉血、散瘀止痛；牡丹皮清热凉血、活血化瘀。这三味药共奏活血化瘀散结消瘿之功，补充君臣之药效不足，共为佐使之药。活血平突散中赤芍苦微寒，归肝经，有清热凉血，散瘀止痛之功；泽兰活血祛瘀消痈；三棱破血行气；穿山甲活血消癥之要药。这四味共为君药，以发挥活血散瘀之功。牡蛎平肝潜阳，软坚散结；鳖甲咸，寒，滋阴潜阳，软坚散结；浙贝苦寒，清热化痰，解毒散结消痈；玄参清热凉血，滋阴泻火，解毒散结；牡蛎、鳖甲、贝母配玄参共为臣药，共奏散结消肿、养阴清热之功，在活血散结的同时而不伤阴。黄药子化痰散结消瘿，清热凉血解毒；山慈菇清热解毒，化痰散结，二者共为佐药，辅助君臣药之药效的发挥。泽泻淡渗利湿为使药，使邪有出路，利水而不伤阴；养目平突散中旱莲草滋补肝肾；女贞子补益肝肾，明目；熟地补血养阴，填精益髓；此三者为君药，共奏补益肝肾之功。白芥子豁痰散结；鳖甲、牡蛎软坚散结；浙贝清热化痰、散结消痈，玄参凉血散结；此共为臣药，主化痰散结之效，与君药共奏标本兼治之法。茺蔚子清肝明目；丹皮清热化瘀；白芍敛阴抑肝；莪术破血行气，此共为佐药，兼顾清热化瘀敛阴之法。方中各味中药协同发挥作用而达到治疗效果。

本实验结果表明，平突散系列复方能够通过增强 MMP 的活性，抑制 TIMP 的活性，调节MMP/TIMP的动态平衡，从而减少CD40L刺激后RFs的ECM合成。三种中药复方中养目平突散效果最佳，原因可能是CD40L引起T细胞依赖的B细胞活化，使Th1/Th2功能失衡，Th1向Th2转化，促使大量的Th2型细胞因子分泌，引起体液免疫应答，疾病趋于静止期，这正与养目平突散对应的疾病期一致。

4 问题与展望

TAO病机复杂，目前西医已从不同角度对TAO的发病机制进行了大量的基础研究。但就目前来看，TAO的发病机制仍不完全明了。中医药与西医治疗相比，其优势在于应用领域广泛、无明显不良反应以及疗效确切等。但是在目前的医学研究中，中医药治疗TAO尚缺乏从共刺激信号通路方面对其作用机制的实验研究及临床研究。通过辨证论治，配合现代分子生物学技术来研究其机制，不仅能完善TAO的治疗方法，而且能够推动中医药在世界舞台的发展进程。

本文不足：

由于甲状腺相关型眼病（TAO）发病机制尚不清楚，国内外很多学者均在尝试通过各种方法对其进行治疗，但在共刺激信号通路方面探讨中药对TAO治疗的研究相对较少。需要进一步以CD40-CD40L共刺激信号通路为切入点，深入探讨中药治疗TAO 的作用机制。

作者贡献：燕树勋进行研究的构思与设计；崔亚萍、余丹丹负责实验操作、实施，资料收集整理；万红撰写论文并对文章负责；陈亚琳进行论文的修订、英文的修订；燕树勋进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。