超高效液相测定棉酚含量方法的建立

2 黄小贞2 赵德刚3

(1.贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部 重点实验室， 贵阳 550025； 2.贵州大学茶学院， 贵阳 550025； 3.贵州省农业科学院/国家农业农村部DUS中心贵阳分中心， 贵阳 550006)

棉花(Gossypiumspp.)是世界上最重要的经济作物之一，棉花种籽纤维是天然纤维的主要来源，富含蛋白质和油脂的棉花种子是极具应用价值的生物原料[1]。棉酚(Gossypol)是棉属植物特有的植物防御素，主要发挥抵御病虫害的生理功能[2]，棉酚衍生物在抗生育[3]，抗氧化[4]，抗癌[5]，抗病毒[6]，抗寄生虫[7]和抗菌[8]等方面具有卓越的功效。但过量的棉酚对人[9-10]和多种单胃动物[11-12]具有不可逆的毒害作用。棉籽中的棉酚含量较高，这严重限制了棉籽的广泛应用。国家制定了一系列严格的质量标准，预防种子饲料中的棉酚对人畜产生毒害，如《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)中规定每千克棉籽饼中包含的游离棉酚不能超过1 200 mg。

检测棉酚含量的方法有高效液相色谱法[13]、高效毛细管电泳法[14]、分子印迹法[15]、比色法[16]、薄层色谱法[17]等。其中高效液相色谱法(HPLC)因其具有分析速度快、灵敏度高、重复性好、选择性高、检测自动化等优点被广泛应用[18-19]，与其他技术联用使HPLC的应用更为便捷[20]。超高效液相色谱法(UItra Performance Liquid Chromatography，UPLC)是在高效液相色谱的原理上进行技术优化产生的新兴技术，UPLC使用粒径低于2μm的小颗粒填充色谱柱，柱子效能显著增加，与传统的HPLC相比，UPLC的分析速度更快、分离度更高、灵敏度更强。目前使用UPLC技术检测棉酚含量的相关报道并不多，建立棉酚UPLC的检测方法尤为必要。

本研究选用流动相配比、流速和柱温3个关键可控参数进行正交试验，建立UPLC检测棉酚的方法，并通过方法学实验检验其可靠性，以期为棉酚的快速检测奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器材料

本实验使用的陆地棉中S 9612种子由中国农业科学院棉花研究所惠赠。

主要试剂：乙腈(MREDA，色谱纯)、磷酸(成都科龙，分析纯)、棉酚标准品(SIGMA，纯度≥95%)。

主要实验仪器：UItiMate 3000超高效液相色谱仪(Thermo Scientific)、Hypersil GOLDTMC 18柱(100 mm× 2.1 mm，1.9μm)。

1.2 试验方法

色谱条件：色谱柱Hypersil GOLDTMC 18柱(100 mm× 2.1 mm，1.9 μm)；乙腈-0.2%磷酸为流动相；检测波长235 nm；进样量10μL。

标准品配制：称取棉酚标准品(精确至0.000 1 g)溶于乙腈-0.2%磷酸水溶液中，配制成0.1、0.5、1、5、20、50μg·mL-1的标准品溶液，0.22μm的水性滤膜过滤，-20 ℃避光暂存。

样品处理：样品于45 ℃低温烘干至恒重，研磨粉碎后过60目筛，称取0.1 g左右(精确至0.000 1 g)溶于乙腈-0.2%磷酸水溶液，超声震荡提取15 min后，1 000×g离心5 min，上清经0.22μm的水性滤膜过滤，-20 ℃避光暂存。

正交试验因素水平：采用正交设计试验对棉酚的检测方法进行优化，考察流速(A)、柱温(B)和乙腈-0.2%磷酸溶液的配比(C)对检测效果的影响(表1)。

表1 正交试验因素水平

水平因 素流速/(mL·min-1)A柱温/℃B流动相配比C10.42180∶2020.72385∶9531.02590∶10

加样回收实验：取同一样品分为4份，其中3份分别加入标准品溶液(终浓度分别为10、20、30μg·mL-1)，在同一色谱条件下重复3次测定棉酚含量。

加样回收率(%)=[(测得量-原有量)/加入量]×100%。

重复性和精密度实验：在优化的色谱条件下，各取1份样品分为6份，各自测定棉酚含量，计算六份样品间的RSD。

2 结果与分析

2.1 正交试验设计和结果

按照正交设计表进行三因素三水平的正交试验(表2)，每组试验均进行标准品的含量测定。

以棉酚标准品浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制表2中所列9个处理组的标准曲线，并求出各组处理的棉酚标准曲线方程(表3)。9个不同色谱检测条件下，标准曲线方程的R2在0.998 9～0.999 9之间浮动，结果表明，9组不同检测条件下，棉酚标准品在0.1～50μg·mL-1的范围内，浓度与峰面积均呈良好的线性关系。

回收率方差分析结果(表4)表明，A(流速)、B(柱温)、C(流动相配比)3个因素对回收率的影响均显著。回收率的极差(表2)大小顺序为：C>A>B，RSD在0.10%～0.94%的范围内波动，且均不超过3%。综合方差分析和极差分析，3个因素对回收率影响程度高低顺序为：C>A>B。

分离度方差分析结果(表4)表明，C因素的影响显著，A、B两因素对分离度的影响不显著。分离度极差分析(表2)的大小顺序为：C>B>A，RSD在0.70%～2.34%的范围内波动，且均不超过3%。综合方差分析和极差分析，3个因素对分离度的影响大小为：C>B>A。

表2 正交试验设计和结果(n=9)

处理编号流速A柱温B配比C回收率/%回收率RSD/%分离度分离度RSD/%11.001.001.0092.820.941.201.1721.002.002.0089.270.500.781.4931.003.003.0098.470.102.341.6042.001.002.0086.190.240.771.6052.002.003.0092.840.142.011.2262.003.001.0090.010.391.440.7173.001.003.0095.370.251.921.4583.002.001.0090.260.160.850.7093.003.002.0088.740.661.341.69K1280.56274.38273.09回收率K2269.04272.37264.20K3274.37277.22286.68R11.524.8522.48K14.323.903.50分离度K24.223.642.89K34.115.126.27R0.210.263.38

注：Kn(n=1,2,3)表示此列中所有因素水平为n的相应指标和，R为列所在因素3水平Kn间的极差值。

表4 方差分析

因素 回收率 分离度 偏差平方和自由度F值p偏差平方和自由度F值pA22.162.00517.290.000.012.000.120.89B3.942.0091.930.010.422.006.860.13C85.422.001993.550.002.172.0035.570.03误差0.042.000.062.00

表3 棉酚标准曲线(n=6)

处理编号标曲方程R21y=4.4898x+0.85120.99962y=4.5874x+2.16270.99943y=1.7665x+0.13350.99994y=2.0884x+0.47290.99945y=2.5803x+0.63190.99986y=2.5599x+1.04250.99897y=1.8277x+0.55470.99948y=4.2308x+0.66430.99969y=2.3858x+0.38670.9999

综合回收率、分离度的极差分析和方差分析结果，3因素对回收率和分离度的影响顺序为：C>A>B。在3个因素中均选取最优水平组合为最佳检测方法：A1B3C3，即流速为0.4 mL·min-1，柱温为25 ℃，乙腈-0.2%磷酸水溶液的配比为90∶10。

2.2 方法学检验

2.2.1标准曲线与灵敏度

正交试验的最佳检测方法：流速为0.4 mL·min-1，柱温为25 ℃，乙腈-0.2%磷酸水溶液的配比为90∶10。在此条件下检测棉酚的标准品溶液，以峰面积为纵坐标，棉酚浓度为横坐标制作标准曲线图(图1)。

图1 优化条件下棉酚浓度标准曲线

曲线方程为y=4.202 6x+0.996 4，R2=0.999 8。

图2 标准品(A)和样品(B、C、D)峰图

棉酚在0.1～50μg·mL-1的浓度范围内，峰面积与棉酚浓度的线性关系良好。结果表明，正交试验优化的棉酚检测方法具有良好的线性关系。

2.2.2加标回收率

结果(表5)表明，加标量为10μg·mL-1的样品回收率在98.00%～99.44%之间，RSD为0.72%；加标量为20μg·mL-1的样品回收率在97.97%～98.67%之间，RSD为0.40%；加标量为30μg·mL-1的样品回收率在97.35%～99.07%之间，RSD为0.87%。3个浓度加标样品的回收率均大于97%，且RSD均小于3%，表明此方法具有良好的回收率和准确度，符合检测的要求。

表5 回收率结果

样号加样量/(μg·mL-1)回收量/(μg·mL-1)回收率/%RSD/%1-19.8098.001-2109.8798.710.721-39.9499.442-119.5997.972-22019.7398.670.402-319.7398.673-129.7299.073-23029.5098.330.873-329.2097.35

2.2.3精密度和重复性

取同1份标准品溶液分为6份，于优化条件下进行棉酚含量测定，计算6份样品间的相对标准偏差RSD。6次进样间的平均RSD为0.27%(n=6)，小于3%，结果表明该方法精密度较高，符合检测要求。

同样取另一浓度标准品溶液分为6份，在优化条件下进行棉酚含量测定，并对其RSD进行计算，得到平均RSD为0.6%(n=6)，小于3%，说明此方法重复性好，符合检测要求。

2.2.4样品检测

在优化的色谱条件下，棉酚的保留时间为1.157 min，样品的保留时间(图2，B、C、D)与标准品的保留时间(图2，A)一致，且峰型良好(图2)，样品的浓度分别为10.72μg·mL-1(图2，B)、20.66μg·mL-1(图2，C)、30.51μg·mL-1(图2，D)。实验结果表明，此色谱条件下样品的检测效果良好，样品和标准品的出峰位置一致，目标峰无分叉、无拖尾，且分离度高，说明优化的UPLC检测方法能很好的将棉酚分离出来。

3 讨 论

棉酚是一种黄色多酚羟基化合物，化学性质不稳定，易氧化，高温和光照易导致棉酚的分解[21]。在棉酚提取和含量检测的过程中，棉酚易分解的特点给含量检测带来误差，低温避光是减少棉酚分解的有利手段。本研究在进行棉酚提取和测定的过程中发现，提取过程应迅速并注意避光，提取的棉酚-20 ℃避光短时保存最佳，检测过程中的样品温度宜设置为4 ℃。

沸点高、热稳定性差、具有生理活性以及相对分子质量较大的物质宜用HPLC或UPLC进行检测[22]，UPLC在HPLC的基础上进行的技术优化使物质检测更为高效便捷。在本研究的正交试验中，9个处理的回收率在86.19%～98.47%之间浮动，回收率均不低于85%，各组的RSD均小于3%，说明UPLC的柱效较高。本研究优化的UPLC方法，保证了分离效果与回收率的同时，低流速的色谱条件节约了流动相的使用，待测物的迅速出峰缩短了检测用时。

本研究优化的色谱条件下棉花样品的检测效果良好，出峰时间短，峰型良好，且分离度高，此UPLC检测方法为棉酚的快速高效检测提供参考。