计算机图像分析与人工计数方法在肺癌EGFR免疫组化中的对比研究

丁宁宁 沈阳市第十人民医院病理科 （辽宁 沈阳 110000）

内容提要： 目的：探讨计算机图像分析取代人工计数方法在肺癌EGFR免疫组化中的准确性和可行性。方法：回顾性选取2012年7月～2018年5月本院收治的行EGFR免疫组化检查的101例肺癌患者作为观察对象。男47例，女54例，年龄39～79岁，平均（61.51±5.53）岁，根据 EGFR蛋白表达情况，比较计算机图像分析与人工计数方法的差异性。结果：在高倍镜（×400）下，人工计数的染色程度平均比值（43.61）较图像采集分析计算的染色程度的平均比值（0.137）显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组方法的一致率为87.93%，Kappa值为0.71，处于0.4～0.75，具有统计学差异（P＜0.05）。结论：肺癌EGFR蛋白表达采用计算机图像分析，定量检测所得结果和人工计数方法的结果一致性较好，但计算机图像分析的准确性和客观性更高。

EGFR免疫组化检测是肺癌诊断方法中较为常用的一种方法，主要是因为该法能够准确对组织细胞特异性蛋白质进行组织学定位，具有操作简便、灵敏度与可重复性较高的优势，在广大医学临床、基础科研工作者当中广受欢迎。然而，大部分研究EGFR免疫组化的方法，仅根据人工计数细胞阳性的个数或者人为主观分级阳性表达来分析研究结果，长此以往，不仅加重工作量，而且研究结果受研究者主观因素影响较多，较难作出客观的评价。随着计算机技术在临床应用的迅猛发展，衍生出很多的图像分析与处理软件，但由于在实际应用中问题较多，尚不能在临床有较好的应用推广[1]。本次研究根据MediaCybernetics公司制作的ImageProPlus图像分析软件，通过观察肺癌EGFR表达，讨论计算机图像分析的可信度。现将研究结果报道如下。

1.资料与方法

1.1 临床资料

回顾性选取2012年7月～2018年5月本院收治的行EGFR免疫组化检查的101例肺癌患者作为观察对象。男47例，女54例，年龄39～79岁，平均（61.51±5.53）岁。组织学分型以2011年肺腺癌多学科新国际分类为标准：乳头型7例；腺泡型53例；附壁型10例；微乳头型1例；实体型30例。其中，已经发现淋巴道转移者31例。按照TNM分期（根据第7版肺癌TNM分期体系为标准）分为：Ⅰ期53例；Ⅱ期17例；Ⅲ期21例；Ⅳ期10例。

纳入标准：①经临床查体、影像检测、病理诊断确诊为肺癌，并且行肺癌EGFR免疫组化的患者；②患者均签署知情同意书；③临床病理诊断由两位经验丰富的医师得出的结果；④年龄为25～80岁；⑤预期患者寿命＞1年。排除标准：①既往或现在心、肝、肾等重要脏器患有严重疾病；②患者本人或其家属没有良好的依从性，研究期间没能积极配合者[2]。

1.2 方法

所有患者EGFR免疫组化的切片均进行人工计数与计算机图像分析。

EGFR免疫组化染色人工计数方法：所有EGFR免疫组化的切片都由同一名资深病理科医师审阅，在审阅过程中，该医师对EGFR免疫组化切片的最初诊断、驱动基因情况和患者的病例信息都不知晓，审阅过程客观且独立进行。首先在低倍镜视野下观察切片的全貌，找到肿瘤细胞所在的区域后，切换至高倍镜，随机抽取5个高倍视野（×400），每个视野计数约100个肺癌细胞。

表1. 两组定性结果的一致性比较(n=101)

EGFR免疫组化的图像采集分析方式：采用图像分析系统,在低倍镜视野下观察切片的全貌，随机选取个视野5个视野，作为空白对照。然后，将低倍镜切换至高倍镜后随机抽取5个高倍视野（可较EGFR免疫组化染色人工计数方法的高倍视野略低）应用计算机图像分析软件观察分析抽取结果，可见暴露EGFR表达的棕黄色区域的面密度、平均光密度以及暴露肺癌肿瘤细胞核所在的蓝色区域的面密度。通过染色比值=（棕色区域面密度÷蓝色区域的面密度)×棕色平均光密度，空白对照的比值定义为阈值，根据阴性和阳性对照的显色情况,在确定无假阳性和假阴性的前提下，图像分析阳性结果为大于阈值的病例。

1.3 观察指标与判定标准

①染色剂强度的评定标准：0分，未能着色；1分，着淡黄色，阳性细胞百分比≤10%；2分，着黄棕色，阳性细胞百分比＞10%，≤50%；3分，着棕褐色，阳性细胞百分比＞50%。根据癌细胞表达的染色强度×阳性细胞百分数计算出结果，当得分≥3时记为阳性，＜3时记为阴性。②比较图像分析定性结果与人工计数结果的一致率，当Kappa值处于0.4～0.75，表示两种方法无显著差异。

1.4 统计学分析

以SPSS22.0软件包进行统计分析，数据由EXCEL 2010软件核对无误后再予处理。不同的临床病理数据下，EGFR免疫组化的图像采集分析的染色程度比值对比分析拟用Kruskal-Wallis秩和检验。临床病理数据与EGFR蛋白表达的定性结果相关性比较拟用χ2检验，以上两组经过客观对比后，若P＜0.05则二者存在较大差异，具有统计学意义。

2.结果

2.1 两组方法EGFR免疫组化的染色结果

经过研究发现，在高倍镜（×400）下，EGFR蛋白表达大部分位于肺癌细胞膜上，胞浆偶见略浅的着色。图像采集分析计算的染色程度的平均比值为0.137，按照空白对照的染色程度比值，定性结果为阳性72例（71.29%），阴性29例（28.71%），阳性率为71.29%；人工计数的染色程度平均比值为43.61，阳性15例（14.85%），阴性86例（85.15%）；对比人工计数较图像分析染色程度平均比值显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 两组方法定性结果分析

观察可见，两组方法的一致率为87.93%，Kappa值为0.71，处于0.4～0.75，具有统计学差异（P＜0.05）。见表1。

3.讨论

随着人们健康意识的提高，有关EGFR蛋白表达的研究成为肺癌研究的热点话题之一。EGFR属于I型生长因子家族,是一种受体性酪氨酸激酶，由胞外区（ECD）、疏水的跨膜区（TM）和胞内区组成，当EGFR蛋白高表达时对放化疗产生抗拒，导致患者的预后不良，将引起组织癌变，促进肿瘤细胞生长或侵袭，形成新生血管和癌细胞远处转移。研究发现，EGFR的表达程度与患者的生存并无显著相关，因此，不能将EGFR的表达作为评价患者预后的独立因素。EGFR经胞浆内转运进入细胞核后，可作为共转录因子调控相关基因的表达，活化后能够与信号转导途径的 细胞内蛋白质PLCT、P13K连接，受体类型和磷酸化结合位点不同，将激活相应的信号蛋白。由于临床不同的免疫组化方法之间存在较大差异，每种方法所致的阳性结果计数方法各不相同，若受到观察者主观判断，评定结果会产生较大影响。其次，临床各项病理数据能影响结果阳性率高低，如果单纯用一个阈值判断EGFR的阳性和阴性，容易导致统计数据计算、分析的结果产生变化。针对本次研究中，通过定量和定性结果分析统计数据，计算得到的结果千差万别。相比之下，定量研究能够更加准确的体现EGFR的蛋白表达情况。计算机图像分析是研究者对图像进行准确定量的一种方式，实验结果会被任何人为或者自然因素产生的误差所改变。故此，在研究者进行免疫组化的染色操作时，应时刻注意控制实验变量，减少系统误差，降低混合偏倚。在图像进行采集的同时预设的参数有必要做到一致，以确保同一组样本之间的可比性。本研究结果显示，人工计数与图像分析染色程度平均比值相比较高，说明EGFR免疫组化的阳性率低；通过人工计数与图像分析定性结果分析，可得出两种方法的一致率较高，但计算机图像分析的准确性和客观性更高。