依那普利对糖尿病大鼠肾脏NF-κB、TGF-β1表达的影响

李文晶 常向云 孙侃 易嘉岱 唐剑

[摘要] 目的 通過观察依那普利对糖病尿大鼠肾脏中核转录因子-κB（NF-κB）、转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响，探讨其对糖尿病肾病的作用及可能的机制。 方法 ①健康雄性SD大鼠（n=60）适应性喂养2周后随机分为两组。链脲佐菌素作用于待造模组（n=50），剂量为一次性35 mg/kg，之后2周继续给予高糖高脂饲料，进行糖尿病造模。成模大鼠（n=40）随机分为依那普利干预组（n=20）和模型组（n=20）。依那普利干预组给予依那普利10 mg/（kg·d）灌胃;正常组和模型组以等量蒸馏水灌胃。模型组和依那普利干预组继续高脂高糖饲料喂养。②各组分别干预8周后，对比以下指标：一般状况、血液生化指标、肾脏组织切片HE染色结构变化、行免疫组织化学染色测定肾脏中NF-κB、TGF-β1表达。 结果 ①雄性SD大鼠的最终存活数：正常组10只、模型组8只、依那普利干预组10只。②正常组的体重为（407.86±23.0）g/只，TC、TG、FBG、HbA1c值分别为（1.67±0.22）mmol/L、（0.68±0.11）mmol/L、（5.07±0.30）mmol/L、（4.44±0.66）%。与正常组比，模型组[（313.18±21.72）g/只和依那普利干预组（334.65±26.23g/只）体重明显减轻（P<0.05）;模型组和依那普利干预组TC、TG、FBG、HbA1c值分别为（2.77±0.23）mmol/L和（2.66±0.33）mmol/L、（2.05±0.17）mmol/L和（2.01±0.19）mmol/L、（14.11±1.54）mmol/L和（13.91±1.43）mmol/L、（11.37±0.67）%和（10.73±1.28）%，较正常组有明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。③肾脏切片HE染色可见模型组有肾脏组织病理损害的改变，而依那普利干预组改变介于正常组和模型组之间;④免疫组化染色后可见模型组肾小球内着色明显，肾间质、肾小管着色明显较正常组深，NF-κB、TGF-β1含量增高，差异有统计学意义（P<0.01），依那普利干预组低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01），高于正常组，差异有统计学意义（P<0.01）。 结论 ①依那普利可以延缓糖尿病肾脏硬化及纤维化的过程;②依那普利可以通过下调DM大鼠肾脏组织中NF-κB和TGF-β1的表达改善DM肾脏病变。

[关键词] 马来酸依那普利;糖尿病肾病;核转录因子-κB;转化生长因子-β1

[中图分类号] R587.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1672-4062（2019）10（a）-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of enalapril on the expression of nuclear factor-kappa B （NF-κB） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in the kidney of diabetic rats with urinary tract， and to explore its effect on diabetic nephropathy mechanisms. Methods 1.Healthy male Sprague-Dawley rats （n=60） were randomly divided into 2 groups after 2 weeks of adaptive feeding. Streptozotocin was applied to the module to be fabricated （n=50） at a dose of 35 mg/kg， and the high-sugar and high-fat diet was continued for 2 weeks to perform diabetes modeling. Model rats （n=40） were randomly divided into enalapril intervention group （n=20） and model group （n=20）. The enalapril intervention group was given enalapril 10 mg/（kg·d） intragastrically; the normal group and the model group were orally administered with distilled water. The model group and the enalapril intervention group continued high-fat and high-sugar diet feeding. After 8 weeks of intervention in each group， the following indicators were compared： general condition， blood biochemical index， HE staining structure change of kidney tissue section， immunohistochemical staining to determine the expression of NF-κB and TGF-β1 in the kidney. Results 1.The final survival number of male SD rats： 10 in the normal group， 8 in the model group， and 10 in the enalapril intervention group. The body weight of the normal group was （407.86±23.0）g/head， and the values of TC， TG， FBG and HbA1c were （1.67±0.22）mmol/L， （0.68±0.11）mmol/L， （5.07±0.30）mmol/L and （4.44±0.66）%， respectively. Compared with the normal group， the model group （313.18±21.72）g/head and the enalapril intervention group （334.65±26.23）g/head] were significantly reduced in body weight，the difference wasstatistically significant（P<0.05）; the model group and the enalapril intervention group TC， The values of TG， FBG and HbA1c were （2.77±0.23）mmol/L and （2.66±0.33）mmol/L， （2.05±0.17）mmol/L and （2.01±0.19）mmol/L，（14.11±1.54）mmol/L and（13.91±1.43）mmol/L，（11.37±0.67）% and （10.73±1.28）% were significantly increased，the difference was statistically significant（P<0.01）. The HE staining of the kidney section showed that the model group had the pathological damage of the kidney tissue， while the enalapril intervention group changed between the normal group and the model group. 4. After the immunohistochemical staining， the model group showed the glomerular coloration. Obviously， renal interstitial and renal tubular staining was significantly deeper than normal group， NF-κB and TGF-β1 levels were increased，the difference was statistically significant（P<0.01）， and enalapril intervention group was lower than the model group，the difference was statistically significant（P<0.01） than normal group，the difference was statistically significant（P<0.01）. Conclusion 1. Enalapril can delay the process of diabetic kidney hardening and fibrosis; 2. Enalapril can improve DM nephropathy by down-regulating the expression of NF-κB and TGF-β1 in the kidney tissue of DM rats.

[Key words] Enalapril maleate; Diabetic nephropathy; Nuclear transcription factor-κB; Transforming growth factor-β1

糖尿病（diabetes mellitus，DM）的发病率在全世界范围内有逐年增高趋势，在我国年龄标准化后DM的发病率高达10%[1]。糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是DM代谢异常引发的严重的并发症，是DM全身微血管病的组成。DN的特征病理改变是肾小球硬化，肾小球和肾小管基底膜增厚及间质增生和纤维化[2]。DN的发病机制复杂，目前认为由高血糖介导的血流动力学、氧化应激、炎症因子等途径导致肾脏损伤，迄今DN发生的确切机制不完全清楚[3]。NF-κB是一种转录因子，在各种组织细胞中广泛存在，通过上调如TGF-β1等多种炎性反应因子的表达，加重肾小球的炎性损伤，是炎性反应的关键调控因子[4-5]。TGF-β1是一种具有调节细胞生长分化的活性多肽，肾脏中TGF-β1分布于肾小管、肾小球与肾间质中，于DN的进展中有着非常重要的作用[6]。马来酸依那普利是血管紧张素转化酶抑制药（ACEI），主要通过抑制肾脏及其他组织的血管紧张素转化酶（ACE）而使血浆血管紧张素II（Ang II）水平降低而发挥作用，但对DN的保护作用研究较少。该实验则通过观察马来酸依那普利对糖尿病大鼠肾脏 NF -κB、TGF-β1表达的影响，来探讨ACEI类药物在保护糖尿病大鼠肾脏中可能具有的作用，报道如下。

1  资料与方法

1.1  动物与试剂

健康雄性SD大鼠60只，体重（180±20）g，购自新疆医科大学动物实验中心，4周龄，清洁级。大鼠饲料（标准型颗粒饲料为原料加入0.3%猪胆盐、5.0%胆固醇、10.0%猪油、3.0%鸡蛋黄、15.0% 蔗糖配制而成）购自玛祖瑞（mazuri）大鼠饲料公司。马来酸依那普利购自江苏扬子江制药股份有限公司。NF -κB、TGF-β1抗体购自北京博奥森公司。链脲佐菌素（Streptozotincin，STZ）购自Sigma公司。

1.2  分组及模型制备

健康雄性SD大鼠（n=60）适应性喂养2周后随机分为两组，待造模组（n=50）一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）35 mg/kg破坏部分胰岛β细胞，建立糖尿病大鼠模型，高脂高糖饲料喂养2周;正常组（n=10）给予等体积枸橼酸缓冲液腹腔注射，普通饲料喂养2周;采大鼠尾尖部静脉血测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），2次FBG均超过16.7 mmol/L者为DM造模成功[7]。成模大鼠（n=40）随机分为模型组（n=20）和依那普利干预组（n=20）。依那普利干预组给予依那普利10mg/（kg·d）灌胃。正常组和模型组以等量蒸馏水灌胃。模型照组和依那普利干预组继续高脂高糖饲料喂养。依那普利干预8周后实验结束。饲养动物总计12周。

1.3  血液标本检测

所有大鼠于第12周末在腹腔按0.5 mL/100 g注射麻药（地西泮、阿托品、氯胺酮注射液各一只与等量生理盐水稀释），于腹主动脉采血高速离心后分离血清，用全自动生化检测仪测定TC（总胆固醇）、TG（总甘油三酯）、FBG（空腹血糖），高压液相色谱法测定HbA1c（糖化血红蛋白）。

1.4  苏木素-伊红染色

所有大鼠于第12周末在腹腔按0.5 mL/100 g注射麻药（地西泮、阿托品、氯胺酮注射液各一只与等量生理盐水稀释），剥离大鼠两侧肾脏，纵向剖开去掉包膜的肾脏，摘取完整扇形组织（包括肾髓质及肾皮质）。4%多聚甲醛灌注固定肾脏组织、酒精梯度脱水、石蜡包埋切片（ 5 μm）。石蜡包埋组织切片依次经过二甲苯脱蜡、酒精脱水、苏木精染色、乙醇漂洗、酒精脱水、伊红复染、酒精脱水、二甲苯透明行常规HE染色，光镜下（×200）观察大鼠肾脏的形态结构改变。

1.5  NF-κB、TGF-β1免疫组织化学染色

大鼠肾脏切片经过脱蜡、置换二甲苯、高压热修复之后冷却至室温;3%过氧化氢室温孵育10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，5 min×3次;滴加兔抗大鼠NF-κB、TGF-β1抗体（第一抗体）4℃冰箱过夜。PBS冲洗，5 min×3次; 依次滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG聚合物（生物素第二抗体）37℃烘箱孵育30 min，PBS冲洗，5 min×3次;，DAB显色试剂盒（1∶100）显色，苏木素复染，分化，返蓝;梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。出现黄棕色为阳性染色，光镜下于低倍镜后转入高倍镜观察，分别进行NF-κB、TGF-β1定量评分： 每张切片随机选取10个肾小球，在高倍镜（×200）视野下阳性表达呈棕黄色。NF-κB、TGF-β1表达水平采取阳性染色面积评分与阳性染色强度评分的乘积表示。

1.6  统计方法

采用SPSS 24.0统计学软件分析数据，对所有数据进行正态性检验，服从正态分布的数据采用（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析;不服从正态分布的数据采用M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验，多组间比较采用多个独立样本非参数分析Kruskal-Wallis检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  一般状况

大鼠的最终存活数：正常组为10只、模型组为8只、依那普利干预组为10只。

模型组和依那普利干预组较正常组饮食、尿量增加，毛色干枯，死亡率高，体重减轻明显，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。模型組和依那普利干预组间差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2  血生化检测

模型组和依那普利干预组TC（总胆固醇）、TG（总甘油三酯）、FBG（空腹血糖）、HbA1c（糖化血红蛋白）水平较正常组有明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。而模型组和依那普利干预组间差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3  肾脏组织结构变化

经HE染色后正常组肾小球、肾小管分布均匀，结构清晰，肾间质未见炎性反应细胞浸润。模型组可见肾小球体积增大，小管上皮细胞、间质水肿，局灶小管坏死。依那普利干预组镜下结构肾小球病变均有改善，介于模型组和正常对照组之间，见图1。

2.4  NF -κB染色结果

经免疫组化染色后NF-κB在正常组极少量表达，着色浅;模型组肾小球内着色明显，肾间质、肾小管着色明显较正常对照组深;依那普利干预组肾小球、肾间质、肾小管着色较糖尿病对照组变浅，但较正常对照组变深，见图2。

2.5  TGF-β1染色结果

经免疫组化染色后TGF-β1在正常组着色浅，表达很少，无阳性着色;与正常组相比，模型组着色深，肾小管上皮细胞、髓质的表达明显增加，呈强阳性表达;依那普利干预组肾小球、肾间质、肾小管着色较模型变浅，但较正常对照组深，见图3。

2.6  NF-κB、TGF-β1表达情况

依据免疫组化染色结果评分方法将NF-κB 、TGF-β1表达情况进行定量评分，并进行统计学分析处理，结果显示：依那普利干预组NF-κB蛋白表达明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）且高于正常组，差异有统计学意义（P<0.01）;依那普利干预组TGF-β1蛋白表达明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）且高于正常组，差异有统计学意义（P<0.01），见表2。

3  讨论

糖尿病肾病是DM最主要的微血管并发症之一，是现今世界上公认的终末期肾损伤（ERSD）最常见的致病原因，是糖尿病致死、致残的主要原因。DN的发病机制复杂，由遗传和环境相互作用，与血糖代谢失常、血流动力学改变、氧化应激、炎症反应、细胞因子等有关[7-8]。DN特征性的病理改变是肾小球病变（包括肾小球体积增大、弥漫性GBM增厚、系膜增生、K-W结节形成）及肾小管萎缩与间质纤维化;大多数动物模型都只能诱导出早期DN病理改变（肾小球体积增大、系膜增生等）[9]。该研究发现模型组肾小球体积增大，小管上皮细胞、间质水肿，局灶小管坏死，符合DN的病理改变。依那普利干预后肾脏病理损害缓解，说明依那普利具有延缓DN 肾脏损伤的作用。

该实验结果显示进行肾脏免疫组化染色后发现NF-κB、TGF-β1在正常组极少量表达，着色浅;模型组着色明显较正常对照组深;而依那普利干预组肾小球、肾间质、肾小管着色较糖尿病对照组变浅，但较正常对照组变深;同时进行免疫组化结果评分显示依那普利干预组NF-κB、TGF-β1表达为2（2，2），高于正常组1（1，1）（P<0.01），低于模型组3（3，3.75）、3（3，3）（P<0.01）。其原因可能为RAAS系统在高血糖的刺激下激活，其中发挥重要作用的是AngⅡ，其在非血流动力学上一方面表现为其与相应受体结合后增加了内皮细胞的通透性以及肾小球滤过膜的通透性;相关研究[10]已经有过详细的报道;另一方面可以促进包括NF-κB和TGF-β1在内的多种细胞因子的表达[11]。多项研究[12]发现使用ACEI后大鼠肾组织中NF-κB活性较未使用ACEI组明显下降，并且减轻了肾脏损害;同时AngⅡ可以激活NF-κB的转录。有研究[13]发现DM大鼠肾组织AngⅡ含量、NF-κB平均吸收光密度值分别为（15.42±3.27）ng/g，（8.96±2.01），明显高正常组[（7.05±1.32）ng/g，（1.14±0.17）]（P<0.05）;经依那普利治疗后为[（9.73±2.02）ng/g，（4.55±1.01）]明显减轻（P<0.01），与该实验得出的结论相符。有研究[14]显示用厄贝沙坦干预糖尿病大鼠后，干预组TGF-β1mRNA表达为（2.9±0.5），明显高于对照组（1.8±0.4）（P<0.05），低于DM模型组（8.6±2.2）（P<0.05），可减少肾脏局部TGF-β1的表达，减缓间质纤维化。在高血糖长时间状态下AngⅡ会利用TGF-β1启动子内的高糖反应元件与高糖结合刺激其基因的转录，使其表达增加而激活TGF-β1/Smads信号通路[15]。由此可见在整个糖尿病肾病进展中AngⅡ可以通过与NF-κB和TGF-β1的直接作用、间接作用以及三者之间的相互作用介导糖尿病肾脏的损害，而ACEI类药物如该实验的依那普利则通过抑制AngⅡ的作用从而达到延缓糖尿病肾脏硬化和纤维化的进程。

综上所述，该实验进一步探究了ACEI类药物对糖尿病肾病的保护机制，为ACEI类药物对糖尿病肾病的作用提供了理论依据，为DN的防治提供了新的可能的靶点。但糖尿病肾病的发病机制十分复杂，确切的作用机制尚有待进一步探讨。

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（收稿日期：2019-07-07）