砒砂岩中植物促生芽孢杆菌的筛选及其对土壤的改良作用

邓 琳，王 涛，殷涂童，何琳燕，杨才千，梁止水

（1.东南大学 土木工程学院，江苏 南京211189；2.农业部农业环境微生物重点实验室 南京农业大学 生命科学学院，江苏 南京210095）

中国砒砂岩区域约为1.67×104km2，主要分布在以内蒙古鄂尔多斯市准格尔旗为中心的晋陕蒙接壤区［1］。裸露的砒砂岩地区生态环境脆弱，水土流失严重，养分含量低，植物难以生长［2］。国内外学者采用了一些生物措施和工程措施，以期解决该地区的植被恢复、土壤改良、水土保持等问题［3-4］。毕慈芬等［5］在砒砂岩区沟床种植沙棘、形成柔性淤地坝是防治沟床下切的有效生物措施之一。肖培青等［6］通过分析砒砂岩岩石成分，研发了砒砂岩改性材料，于2015年建设了一座砒砂岩改性材料淤地坝示范工程。姚文艺等［7］研究了一种环境友好型抗蚀促生技术，使砒砂岩区产沙量减少90%以上。从整体来看，如何通过新的技术手段改善植被立地条件，缓解有机质和速效磷等植物生长限制因子，有效防治水土流失，仍是当前砒砂岩土壤改良亟待解决的关键技术。

微生物广泛分布于各种环境中，在一定条件下有利于植物生长。生活在土壤、植物根际或内部的植物促生细菌（plant growth promoting bacteria，简称PGPB）在农业生产和环境保护领域有很好的应用前景［8-10］。目前已鉴定出多种PGPB菌株，主要种类包括 芽 孢 杆 菌 属（Bɑcillus）、假 单 胞 菌 属（Pseudomonɑs）、固氮菌属（Azotobɑcter）、固氮螺菌属（Azospirillum）等。芽孢杆菌是一类能够产生芽孢、抗逆性较强的细菌，多数菌株能够固氮、溶磷，并产生生长素等植物激素，能提高植物对干旱、高盐和重金属的抗逆性［11］。砒砂岩土壤中的芽孢杆菌种群及其促生特性还有待挖掘，国内外对于芽孢杆菌应用于砒砂岩土壤改良的设想也是鲜有报道。

本研究从砒砂岩区域采集土壤和植物样品，分离筛选抗逆性强的芽孢杆菌，探究植物促生芽孢杆菌的生物学特性和改善砒砂岩土壤性质的作用，从而为利用PGPB来改善砒砂岩区植被立地条件和防治水土流失的科学设想提供生物资源和试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

样品为砒砂岩区域道路边坡土壤、煤矿排土场土壤和苜蓿根系。

LB 培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，水1 000 ml，p H 值7.0。固体培养基中添加20 g琼脂。

供 试 植 物：黑 麦 草（Lolium perenne），苜 蓿（Medicɑgo sɑtivɑ），种子购自南京市栖霞区春茵种子有限公司。

1.2 砒砂岩土壤和植物内生芽孢杆菌的分离筛选

采用热处理和选择性培养基分离、纯化芽孢杆菌。参考杨丽等［12］和庞海东等［13］的方法，称取采集的土样1 g，放入盛有99 ml无菌水的锥形瓶中，充分振荡。再放入85 ℃恒温水浴锅中水浴15 min，制成浓度为1／100的土壤悬液。再吸取1 ml土壤悬液加到9 ml的无菌水试管中，混匀，依次梯度稀释后，分别取0.1 ml稀释液涂布在LB 固体培养基上。培养72 h后选取菌落数适量的平板，随机挑取长势良好的单菌落，多次划线分离纯化，保存待用。

将植物根部用热的去离子水冲洗干净，用75%的酒精和2.5%的NaClO 先后消毒，并用无菌水浸洗数次。将表面消毒的根部0.1 g置于无菌研钵内研磨至匀浆，加1 ml无菌水混匀，再放入85 ℃恒温水浴锅中水浴15 min。取0.1 ml悬液涂布于LB固体培养基上，同时取最后一遍浸洗的无菌水0.1 ml涂布于LB固体培养基，以检测样品表面消毒是否彻底。28 ℃培养72 h 后，若无菌水涂布的平板未长菌，则从LB 平板上挑选长势良好的单菌落，多次划线分离纯化后4 ℃保存。

1.3 菌株的生物学特性测定

将分离纯化得到的芽孢杆菌接种至LB 液体培养基中培养至对数期，吸取50μl菌液转接到液体LB培养基试管中静置3 d，观察生物膜产生的情况。挑选产生物膜能力强的菌株于4 ℃保存。

菌株产吲哚乙酸（IAA）测定参考Gordon等［14］的方法，铁载体能力测定参考Schwyn等［15］的方法。菌株的鉴定采用16S r RNA 基因序列同源性分析，参考Xi等［16］方法提取细菌总DNA 和PCR 扩增16S r RNA 基因产物，将16S r RNA 基因扩增产物送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。用BLAST 软件将所获得序列与GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）和Ez Taxon（http：∥www.eztaxon.org）中已知的16S r RNA 基因序列进行比对分析，采用MEGA7.0构建系统进化树。

1.4 菌株对砒砂岩的改良作用

将供试菌株接种于LB液体培养基中，30℃，150 r／min振荡培养至OD600为1.0（约1.00×108CFU／ml）时，取菌液20 ml加到120 g砒砂岩土壤中（土壤置于塑料杯中），对照添加等量LB 培养基。再加水10 ml，用保鲜膜覆盖于塑料杯口，保持土壤的湿度，静置一个月。

采用梯度稀释、平板培养的方法计算土壤中细菌总数。采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法［17］测定砒砂岩土壤中蔗糖酶活性，以24 h后1 g土壤葡萄糖的毫克数表示。参照《土壤农化分析》［18］，采用重铬酸钾容量法—稀释热法测量土壤中有机质的含量。采用0.5 mol／L Na HCO3浸提—钼锑抗比色法测量土壤中速效磷的含量。采用NH4OAc浸提—火焰光度法测定土壤中速效钾的含量。

1.5 菌株对苜蓿和黑麦草生长的影响

供试土壤采自内蒙古砒砂岩区，布置盆栽试验，每个穴盘装200 g砒砂岩土壤，并向穴盘中添加去离子水20 g，使整个土壤环境保持一定的干旱程度。用5%的次氯酸钠溶液对黑麦草和苜蓿种子表面消毒20 min，均匀地洒在铺有湿润无菌纱布的培养皿中，放置于30℃黑暗培养箱中催芽。挑取大小一致露白后的种子播种于育苗盘，当种子芽长到1 cm 左右时，挑选长势均匀的黑麦草和苜蓿幼苗，用1.4方法制备的菌悬液蘸根处理30 min，对照浸泡无菌LB培养基。蘸根结束后将幼苗移栽至穴盘中，每个处理3个重复。隔半个月后再接种20 ml菌悬液处理，对照接种等量无菌LB培养基。一个月后测量黑麦草和苜蓿的地上部干重和根部干重，以评判菌株对植物的促生效果。

1.6 统计分析

所有试验数据均采用Microsoft Office Excel 2010软件作图，采用SPSS 25.0 对数据进行单因素方差分析，p＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 供试芽孢杆菌的生物学特性

从砒砂岩土壤和苜蓿中共分离得到12株芽孢杆菌，其来源见表1，菌落形态如图1 a所示。

表1 供试芽孢杆菌的来源和促生特性

12株芽孢杆菌的菌落均为圆形，颜色介于乳白色和淡黄色之间。菌株P75和P23的菌落是半透明的，其余菌落均为不透明。菌株P76，C47，C48 和F84菌落边缘不整齐；菌株F83，G36，B29，G37，C48和P77 菌落表面褶皱较为丰富，其余菌株的菌落表面光滑、湿润。

图1 供试芽孢杆菌的菌落形态（a）和形成的生物膜（b）

供试芽孢杆菌在LB 液体培养基表面上均能形成生物膜（图1b）。除菌株P23的生物膜较少之外，其余菌株产生物膜的能力都很强。菌株能够在液体LB培养基和空气交汇的界面处产生厚厚的一层膜，产膜细菌主要生存和聚集在这层膜中，所以下层LB培养基比较澄清，而产膜弱的菌株不能很好地形成生物膜，所以下层LB液体呈浑浊状。生物膜的产生可以提高菌株对不良环境的抗逆性，同时可以提高菌株在植物根系的定殖能力［19-20］。

植物促生细菌在其生长代谢过程中能够产生一些促进植物生长发育的化合物，其中IAA 被认为能够使植物产生更多的次级根和不定根，促进植物生长；铁载体被认为能够结合铁离子，缓解植物在不良环境下缺铁的症状，促进植物的生长［8］。供试芽孢杆菌的促生特性如表1所示。这些芽孢杆菌都能产生铁载体和吲哚乙酸（indole acetic acid，IAA）。除菌株P76以外，其他菌株产铁载体的含量均很高，尤其是菌株F84的铁载体产量达到＋＋＋＋＋。不同菌株的IAA 产量在18.3～49.5 mg／L 之间，其中菌株P75的IAA 产量最低，F83的IAA 产量最高。

以菌株总DNA 为模板，采用通用引物进行PCR扩增16S r DNA，PCR 产物经纯化、测序，用BLAST软件将序列与GeneBank 中参比菌株的16S r DNA序列进行比对，构建的系统发育树如图2所示。菌株F83，F84，P75，P76 和P77 均 与B.hɑlotolerɑns 相近，同源性达到99.9%，且P75与F83，P76与P77更相近，同源性为100%，归为B.hɑlotolerɑns同一种。菌株C46，C47，C48 与B.siɑmensis 相近，而B29，G36，G37与B.ɑtrophɑeus的同源性更近，同源性为99.9%。P23 与其他筛选菌株的同源性都较远，与B.zhɑngzhouensis的同源性为99.9%。

2.2 供试芽孢杆菌对砒砂岩土壤特性的影响

有机质、速效磷和速效钾在一定程度上能够反映土壤肥力［18］。由图3 可知，接菌处理可以影响砒砂岩土壤有机质、速效磷和速效钾含量。如图3a所示，与对照（CK）相比，除菌株B29，C46，C48 和P23 以外，9株供试芽孢杆菌都能够显著增加砒砂岩土壤的有机质含量（5.0%～24.7%），尤其是菌株G37 和P75处理的砒砂岩土壤有机质含量分别显著增加了23.9%和24.7%（p＜0.05）。

图2 基于供试芽孢杆菌16S rDNA序列构建的系统发育树

如图3b所示，除菌株B29，C46，G36和G37以外，其他菌株均能显著提高砒砂岩土壤中速效磷的含量（7.2%～17.1%，p＜0.05），尤其是菌株C47，F84，P23，P75和P77能够使速效磷含量显著提高10%以上。

此外，与未接菌对照相比，菌株C48，F83，P75和P77能够显著提高砒砂岩土壤的速效钾含量（图3c），其中菌株F83和P75处理可使速效钾含量分别显著增加13.3%和21.0%。

图3 供试菌株对砒砂岩土壤有机质含量（a）、速效磷含量（b）和速效钾（c）的影响

如图4a所示，与未接菌对照相比，C46，C47 和C48菌株处理没有增加砒砂岩土壤可培养细菌数量，除此以外，其他菌株都增加了砒砂岩土壤中的可培养细菌数量，其中接种B29，F83，G36，P23，P75，P76和P77菌株的砒砂岩土壤中可培养细菌数量均超过107CFU／g，且数量差异表现为：P23＞P77＞P75＞P76＞F83＞B29＞G36。

蔗糖酶活性反应了土壤有机碳积累与分解转化的规律，蔗糖酶活性的提高有助于土壤的改良［17］。如图4b所示，接菌处理能够改变砒砂岩土壤中蔗糖酶的活性。与对照相比，B29，C46，F83，F84，P75，P76和P77菌株能够显著提高土壤蔗糖酶活性（42.4%～65.7%，p＜0.05），其中，菌株C46，F83，P75 和P76处理的砒砂岩土壤蔗糖酶活性显著增加了50%以上。

2.3 供试芽孢杆菌对苜蓿和黑麦草的促生作用

供试芽孢杆菌在不同植物上的促生效果表现出差异（如表2所示）。与对照相比，在砒砂岩土壤中菌株F83，P75和P76能促进苜蓿根部干重增加明显（81.7%～86.1%，p＜0.05），但苜蓿地上部干重增加量差异不显著。此外菌株P75能够显著增加黑麦草的地上部干重（22.3%）和根部干重（29.9%，p＜0.05）。由此可见，菌株P75对苜蓿和黑麦草均有促生作用。

3 讨论

植物根际促生细菌是土壤生态系统中的活跃组分，影响着土壤有机质的转化和养分循环，在促进植物多样性形成、退化生态系统的恢复与重建过程中具有十分重要的作用［21］。迄今为止，国内外已发现的植物促生细菌以芽孢杆菌和假单胞菌为主，芽孢杆菌以其抗逆性强等优点又成为了农业和环境应用领域的热点之一。砒砂岩土壤无水坚硬如石，遇水松软如泥，对该特殊土壤中微生物种群的调查研究较少。

图4 接菌处理对砒砂岩土壤可培养细菌数量（a）和蔗糖酶活性（b）的影响

表2 供试芽孢杆菌对苜蓿和黑麦草的地上部和根部干重的影响

本研究从砒砂岩土壤和苜蓿中筛选产生IAA、铁载体和生物膜的芽孢杆菌，发现这12株芽孢杆菌可以分为4个类群，具有功能多样性、遗传多样性和种群多样性，为植物促生细菌资源挖掘和改良砒砂岩土壤肥力提供了丰富的菌株资源。

砒砂岩区域土壤肥力低下，植物难以生长，成为黄土高原侵蚀最剧烈、治理难度最大的地区，因此提高土壤肥力是改良砒砂岩的重要环节之一。土壤肥力包括土壤物理、化学和生物学性质，有机质、速效磷钾含量和土壤酶活性是其重要指标［18］。砒砂岩土壤有机质含量通常较低［22］。本研究中有9个接菌处理组显著增加了砒砂岩土壤的有机质含量（5.0%～24.7%），而对照组因为添加了以胰蛋白胨和酵母提取物为主的LB培养基，有机质含量增加达到11.2 g／kg，说明添加有机质和接菌处理可以在一定时间内快速提高砒砂岩土壤的有机质含量。菌株P75增加土壤有机质含量的作用更显著，可能与接菌处理后可培养细菌数量和蔗糖酶活性显著增加有关，因为细胞通常富含有机质，蔗糖酶可以促进土壤有机碳转化。

砒砂岩区域的植被恢复和重建是防治水土流失的重要工程，沙棘、紫花苜蓿、柠条锦鸡儿和多年生黑麦草等植物被大量试种［22-25］，考虑到多年生黑麦草根系发达、紫花苜蓿能够固氮增肥，选作本研究的供试植物材料。在实验室条件下B.hɑlotolerɑns P75菌株能够促进黑麦草和苜蓿幼苗在砒砂岩土壤中的生长，其他菌株的促生作用不显著。通常认为能够分泌IAA 和铁载体的细菌具有良好的促生作用，但本研究中F83和F84产生较多IAA 和铁载体，其对苜蓿和黑麦草的促生作用一般，而产生IAA 和铁载体较少的P75菌株促生作用最好，由于P75菌株分离自生长于砒砂岩土壤中苜蓿内，可能更适应植物。此外，植物促生芽孢杆菌P75对植物生长和修复砒砂岩土壤的影响也会受多种因素共同作用，其促生作用机制和改良砒砂岩的工程化应用还需进一步研究。

4 结论

砒砂岩地区的水土流失引起了严重的环境生态问题，其修复治理涉及化学、物理、植物、农业、生态和工程等诸多方面。植物措施在一定程度上减少水土流失，但有局限性，利用植物促生细菌强化植物修复，有望发展修复治理砒砂岩土壤的新途径。本文从内蒙古典型砒砂岩土壤和当地优势植物中筛选得到12株产生IAA，铁载体和生物膜的芽孢杆菌，反映出砒砂岩土壤细菌的生物多样性。其中B.hɑlotolerɑns P75菌株可以提高砒砂岩土壤的有机质含量、速效磷钾含量和可培养细菌数量，增强土壤蔗糖酶活性，还能促进苜蓿和黑麦草在砒砂岩土壤中生长，为微生物强化植物改良砒砂岩土壤提供了理论依据和生物资源。