ATG12基因对易卒中自发性高血压大鼠大脑组织自噬的影响

李浩东,徐 虹,范永新,刘 猛,朱月敏,马俊平,栾 松

(涿州市医院神经内科,涿州 072750;*通讯作者,E-mail:drluansong@sina.com)

脑梗死又被称为中风,是导致成人残疾的主要原因,排在癌症和心脏病之后成为全球死亡率第三的疾病[1]。脑梗死与多种危险因素相关,包括高血压和糖尿病等,其中高血压对脑梗死的发生最有影响力[2]。因此,对于高血压合并脑梗死的研究具有重要的意义。

自噬相关蛋白12(autophagy-related protein 12,ATG12)是一种参与自噬囊泡形成的泛素样蛋白(ubiquitin-like protein),能够通过调控自噬复合物的形成参与细胞的自噬和凋亡相关过程以及组织器官的损伤修复过程[3]。最近研究表明,在缺氧诱导的脑损伤模型中ATG12表达上调,ATG12与缺氧/复氧诱导脑损伤的神经细胞凋亡有关[4]。我们推测ATG12可能影响卒中和高血压的发生发展。本研究主要探索了ATG12与易卒中自发性高血压大鼠血压、大脑组织氧化应激水平和自噬的关系,为高血压合并脑梗死临床治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性易卒中自发性高血压(SHR/SP)大鼠30只,6-8周龄,体质量(200±20)g,雄性WKY大鼠10只,6-8周龄,体质量(200±20)g,均为SPF级,购于凯学生物科技有限公司,生产许可证号:37009200009107,由承德医学院实验动物中心饲养,室温(23±2)℃,相对湿度50%,光照时间和黑暗时间各12 h。

1.2 主要试剂

ATG12 shRNA腺相关病毒(ATG12 shRNA-AAV2)(汉恒生物科技有限公司),SOD检测试剂盒和MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);ATG12引物和GAPDH引物(生工生物工程股份有限公司);LC3A/B兔单克隆抗体、p62兔单克隆抗体和ATG12兔单克隆抗体(美国CST公司);GAPDH兔单克隆抗体(博奥森生物技术有限公司)。

1.3 动物分组与造模

30只雄性SHR/SP大鼠随机分为SHR/SP空白组(SHR/SP)、病毒对照SHR/SP组(NC shRNA SHR/SP)、ATG12干扰组(ATG12 shRNA SHR/SP),每组10只。10只雄性WKY大鼠为WKY对照组(WKY)。ATG12干扰大鼠模型的建立:ATG12干扰组(ATG12 shRNA SHR/SP)大鼠尾静脉注射ATG12 shRNA腺相关病毒(病毒对照SHR/SP组大鼠注射NC对照腺相关病毒),滴度为2.0×1011gene copies/ml,稀释成100 μl进行尾静脉注射,注射2周,然后检测大鼠大脑组织ATG12的表达水平。

1.4 大鼠血压的测定

采用无创尾动脉测压仪分别测定SHR/SP空白组、病毒对照组和ATG12干扰组大鼠和WKY大鼠血压。将安静状态下的大鼠放入大鼠固定仪，将鼠尾套入无创血压测量仪，37 ℃预热10-15 min，测定并记录各组大鼠尾动脉血压。每只大鼠重复测量3次，取其平均值。实验取收缩压为检测指标，以mmHg表示。

1.5 荧光定量PCR检测ATG12基因表达

脱颈处死大鼠,迅速分离大脑组织,Tizol法提取组织总RNA,按照说明书逆转录成cDNA,以获得反应体系的cDNA模板,采用两步法进行实时荧光定量PCR反应,具体反应条件如下:95 ℃ 30 s预变性;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,40个循环。以GAPDH为内参,根据Ct值计算大鼠大脑组织的ATG12基因相对表达量。荧光定量PCR引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR引物序列

Table 1 The primer sequence for real-time PCR

名称序列(5′-3′) ATG12F:TCTTAGACTGCTGTGCCTGCR:AACTTGTTTGACGCCTTCGCGAPDHF:AGAAGGCTGGGGCTCATTTGR:AGGGGCCATCCACAGTCTTC

1.6 组织抗氧化水平的检测

如1.3处理大鼠,然后迅速分离大鼠新鲜大脑组织,冰上碾磨成悬液。按照SOD和MDA检测试剂盒操作手册,检测各组大鼠大脑组织中SOD和MDA的含量。

1.7 大脑组织蛋白表达的检测

取大鼠大脑组织置于冰上碾磨匀浆，裂解细胞并测定蛋白浓度，取总蛋白(40 μg)进行SDS-PAGE电泳分离蛋白质，电泳后将蛋白转移至PVDF膜，封闭液封闭1 h，分别加入1∶300稀释的一抗(LC3A/B，p62，ATG12,GAPDH)，4 ℃孵育过夜。加入1∶5 000稀释的二抗室温孵育45 min，洗涤后加入显色液显色拍照，用ImageJ2x软件进行灰度值分析。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 ATG12在SHR/SP大鼠中高表达

首先检测ATG12在SHR/SP大鼠中的表达水平,qRT-PCR结果显示,与WKY大鼠相比,SHR/SP大鼠大脑组织ATG12的mRNA表达水平显著升高(P<0.01,见图1)。

与WKY大鼠比较，**P<0.01

2.2 ATG12对SHR/SP大鼠血压的影响

与WKY大鼠组比较,SHR/SP组大鼠血压显著升高(P<0.01)。与NC shRNA SHR/SP组比较,ATG12 shRNA SHR/SP组大鼠血压显著降低(P<0.01,见图2)。

与WKY组比较，**P<0.01;与NC shRNA组比较，##P<0.01

2.3 ATG12对SHR/SP大鼠大脑组织氧化应激水平的影响

结果显示,与WKY大鼠组比较,SHR/SP组大鼠大脑组织SOD活力显著降低,MDA含量显著升高(P<0.01)。与NC shRNA SHR/SP组比较,ATG12 shRNA SHR/SP组大鼠大脑组织SOD活力显著升高,MDA含量显著降低(P<0.01,见图3)。

与WKY组比较，**P<0.01;与NC shRNA组比较，##P<0.01

2.4 ATG12对SHR/SP大鼠大脑组织自噬水平的影响

Western blot检测结果显示,与WKY大鼠组比较,SHR/SP组大鼠大脑组织LC-3A/B蛋白表达水平显著升高,P62蛋白水平显著降低(P<0.01)。与NC shRNA SHR/SP组比较,ATG12 shRNA SHR/SP组大鼠大脑组织LC-3A/B蛋白表达水平显著降低,P62蛋白水平显著升高(P<0.01,见图4)。

与WKY组比较，**P<0.01;与NC shRNA组比较，##P<0.01

3 讨论

流行病学研究表明,全球每年约有1 500万人成为脑梗死的受害者,其中500万人在诊断后1年内死亡,另有500万人将永久残疾。一旦发生脑梗死,有效的治疗方法非常有限[5]。因此,预防被认为是遏制脑梗死大流行的最有效策略。研究与脑梗死发生相关的基因,对于脑梗死的预防具有重要的意义。

由氧化剂生成和抗氧化防御之间的不平衡引起的氧化应激在脑老化、神经退行性疾病和脑梗死的发生中起重要作用[6]。与其他组织相比,大脑的氧气消耗量更大,抗氧化能力更强,这使得氧化应激可能成为脑梗死的原因[7]。SOD酶活性是评估临床中抗氧化活性的有用工具。机体在外界有害条件的刺激下,体内氧化平衡被打乱,SOD等抗氧化酶表达减少,导致ROS积累增多,机体处于氧化应激状态。MDA是一种脂质过氧化产物,MDA水平与缺血性卒中的大小和临床结果相关[8]。

本研究检测了高血压合并脑梗死对大鼠大脑组织氧化应激水平的影响,结果显示,SHR/SP组大鼠大脑组织SOD活性显著降低,MDA水平升高,表明脑梗死与机体氧化应激有关,这与其他学者的研究结果一致。抑制ATG12表达能够提高脑早衰大鼠大脑组织SOD活性,抑制MDA水平,证实提高机体抗氧化能力并抑制机体氧化应激水平,能够缓解脑梗死的发生,这与其他学者的研究结果一致。

ATG12(autophagy-related protein 12)也叫自噬相关蛋白12,是由ATG12基因编码的与细胞自噬和凋亡相关的重要蛋白[9]。ATG12是参与自噬的酵母蛋白的人类同源物。ATG12与ATG5通过泛素样共轭系统形成共价连接,ATG12-ATG5复合体能够进一步促进ATG8与脂质磷脂酰乙醇胺的结合,参与调节细胞自噬[10]。有研究显示,ATG12参与诱导细胞凋亡,该蛋白通过与Bcl-2家族的抗凋亡成员的相互作用抑制抗凋亡蛋白的活性,促进细胞凋亡的发生[11]。

自噬是受损或功能失调的细胞质组分的降解和再循环过程[12]。LC3又叫自噬相关蛋白,是自噬标志物,自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-Ⅰ)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-Ⅱ),LC3-Ⅱ/Ⅰ值反应自噬水平的高低。P62是自噬的选择性底物之一,在自噬的过程中被降解,含量显著降低[13,14]。近几年来,自噬被认为是脑损伤病理学变化。脑梗死引起自噬过度激活,对组织器官产生损伤。国外研究表明,在脑梗死过程中,大脑组织自噬水平显著升高[12,15]。

本次研究探索了自噬水平与易卒中高血压的关系,实验结果显示,与WKY大鼠相比,SHR/SP组大鼠大脑组织中LC3的表达水平显著升高,P62的表达水平显著降低。揭示大脑组织的自噬水平与易卒中高血压的发生有关。抑制ATG12的表达水平能够抑制LC3表达,促进P62的蛋白表达,抑制了大脑组织自噬水平,可缓解高血压的发生。本研究仅证实了抑制ATG12的表达水平能够抑制易卒中高血压和大脑组织自噬水平,而上调ATG12是否会促进卒中和高血压的发生以及ATG12通过自噬通路如何缓解易卒中高血压还需要进一步实验研究证明。

总之,本研究通过SHR/SP大鼠建立了ATG12低表达SHR/SP大鼠模型,对ATG12与SHR/SP大鼠血压、大脑组织氧化应激和自噬之间的关系进行探索,为ATG12在脑梗死的发生和预防中的进一步研究提供了实验基础。