温光诱导下甜菜抽薹和开花相关基因的AFLP研究

梁乃国，程大友，崔 杰，代翠红，罗成飞

(1.淮阴工学院，江苏 淮安 223002；2.哈尔滨工业大学化工学院，哈尔滨 150001)

0 前言

糖甜菜属于长日照(long-day，LD，16 h/8 h)二年生作物，第一年为营养生长，形成肥大的块根，第二年为生殖生长，抽薹、开花和结籽。但在糖甜菜生产实践中，常常出现当年抽薹开花的现象，即：早抽薹。早抽薹对甜菜块根的质量和产量均有不同程度的影响。研究发现早抽薹糖甜菜根的重量，含糖量，清汁纯度和可回收的糖含量均显著降低，阻碍蔗糖结晶的有害成分如K+、Na+和α-N则明显增加。并且早抽薹糖甜菜根部解剖结构分析显示维管束环数较正常植株显著减少、根的木质化程度严重、纤维化明显，所以早抽薹糖甜菜在制糖工业生产上加工价值极低。本课题研究的目的是明确甜菜在春化和光周期条件下抽薹、开花过程中差异基因表达，为进一步明确温度和光周期诱导甜菜抽薹、开花的分子机制提供前期基础。

2 材料与方法

2.1 生物材料

甜菜品系DY14-O来源于哈尔滨工业大学甜菜课题组。

2.2 方法

2.2.1 生物材料

生物材料2014年5月播种DY5-O甜菜种子，于2014年10月初收获母根，选取100株生长健康根重大约700-850 g的甜菜母根100株沿着生长点平均切瓣，共200瓣，100瓣春化(4-5℃)处理16周(16 W)，100瓣非春化处理16周(16 W)，随后移栽到试验田中，100瓣春化甜菜中的50瓣长日照(VLD)(光照16 h/黑暗8 h)条件下生长，另50瓣短日照(VSD)(光照8 h/黑暗16 h)条件下生长。100瓣非春化甜菜中的50瓣长日照(NVLD)(光照16 h/黑暗8 h)条件下生长，另50瓣短日照(NVSD)(光照8 h/黑暗16 h)条件下生长。间隔5天采集一次叶片，直至开花时停止采集叶片。

2.2.2 甜菜总RNA提取

使用全式金TransZolTMPlant RNA试剂盒提取RNA.使用1.0%的琼脂糖凝胶和Bio Drop Lite PC超微量可见紫外光分光光度计检测RNA质量和浓度，合格的RNA样品使用Trans Script One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反转录试剂盒发转录成cDNA。

2.2.4 双链cDNA的纯化

(1)向终止反应的离心管中，移入180 μL的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，旋涡振荡5-10秒混匀。室温下15 000 rpm离心1 min，转移水层到新的离心管中。

(2)加入180 μL的氯仿/异戊醇(24∶1)，旋涡振荡5-10秒混匀。室温下15 000 rpm离心1 min，转移水层到新的离心管中。

(3)加入10 mol的乙酸铵60 μL。加入2.5倍体积的乙醇(600 μL)混匀，室温放置10 min。

(4)4℃下15 000 rpm离心15 min，弃掉上清液，注意不要吸取沉淀。加入70%的乙醇4℃下15 000 rpm离心5 min。

(5)去除上清液，干燥沉淀。用TE buffer溶解沉淀，储存在-20℃冰箱中。

2.2.5 cDNA的双酶切

选择EcoR I和Mse I作为双酶切体系的酶，先用EcoR I酶切双链cDNA，再用Mse I进行酶切，酶切体系如表1所示。

表1 cDNA酶切体系

酶切程序如表2所示。

表2 酶切程序

取5 μL酶切产物1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2.2.6 寡聚核苷酸接头的连接

单链接头需要进行变性和复性形成双链接头，接头序列见表3。变性和复性过程为将水浴锅加热至95℃进行变性，加入接头溶液MseI溶液(各25 μL)和EcoRI溶液(各10 μL，加水稀释至50 μL)，水浴15 min，取出室温缓慢冷却至25℃，置于4℃冰箱中保存。

表3 接头序列

2.2.7 cDNA的预扩增和选择性扩增

将连接产物稀释10倍，用于PCR预扩增，再将PCR预扩增产物稀释100倍，作为选择性PCR扩增的模板。选择性PCR扩增的引物序列见表4。

表4 AFLP选择性扩增引物

选择性扩增采用Touchdown PCR程序，程序设定如表5所示。

2.2.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染

聚丙烯酰胺变性凝胶的配制方法、电泳方法和银染方法，以及后续的目的条带回收和感受态细胞的制备等参照本实验室孟祥雯的方法[30]。

2.2.9 测序结果比对分析

将测序的结果在NCBI (National Center for Biotechnology Information)美国国立生物技术信息中心网站进行比对和分析。

3 结果与分析

3.1 抽薹和开花统计分析

春化作用诱导甜菜抽薹，没有经过春化处理的甜菜不抽薹保持营养生长状态；甜菜抽薹后在长日照光周期条件下出现开花性状，而在短日照光周期条件下只抽薹不开花；非春化处理的甜菜无论在长日照还是短日照光周期条件下，均处于营养生长状态，如表6所示。

表6 甜菜抽薹和开花统计分析

3.2 样品预扩增结果

从春化长日照和短日照甜菜16 W、19 W、20 W时期和非春化长日照和短日照甜菜16 W、19 W、20 W时期甜菜叶片中提取甜菜总RNA，然后将RNA逆转录合成双链cDNA，再用EcoR I和Mse I内切酶对cDNA进行双酶切，将酶切产物进行寡聚核苷酸接头连接，再将连接产物稀释10倍，PCR预扩增。

3.3 甜菜叶片中基因表达差异

应用256对引物组合对春化长日照、春化短日照、非春化长日照和非春化短日照甜菜三个发育时期叶片中的cDNA进行AFLP分析，发掘差异表达基因，共检测到372个差异基因片段，扩增片段长度在65-700 bp之间。对差异表达的基因片段进行3次重复实验验证，

发现49条为假阳性片段，对323条表达较强的差异片段进行回收、克隆并测序，菌液PCR扩增结果如图1所示。成功测序的有286条，经验证发现20条为假阳性片段，剩余的266条序列在甜菜数据库中比对分析，所得结果按照NCBI数据库中的功能和参与的生物途径分类。

M：DL2000，A：春化长日照16 W，B：春化短日照16 W，C：非春化长日照16 W，D：非春化短日照16 W，E：春化长日照19 W，F：春化短日照19 W，G：非春化长日照19 W，H：非春化短日照19 W，I：春化长日照20 W，J：春化短日照20 W，K：非春化长日照20 W，L：非春化短日照20 W。图1 甜菜叶片cDNA目的条带菌液PCR电泳图

3.4 叶片中差异基因的同源性比对分析

3.4.1 不同处理条件下16 W时期叶片中差异基因分析

春化长日照、春化短日照、非春化长日照和非春化短日照16 W时期叶片中共筛选出63个差异片段，其中春化长日照23个、春化短日照14个、非春化长日照11个、非春化短日照15个。在NCBI数据库中通过Nucleotide BLAST比对分析进行功能分类发现8个基因与催化作用相关、5个基因与光合作用相关、3个基因与运输作用相关、3个基因与激活位点相关(图2)。通过NCBI数据库对16 W时期的差异基因进行生物途径分析，发现3个基因参与氧化磷酸化和代谢途径、2个基因参与内质网中蛋白质的加工、2个基因参与光合天线蛋白质途径、2个基因参与核糖体途径、4个基因参与光合作用代谢途径、2个基因参与光合生物中碳固定和碳代谢途径、1个基因参与植物激素信号转导途径见图3所示。

注：a：功能未知b：激活位点c：ATP相关d：催化作用e：光合作用f：运输因子g：核糖体h：F-box相关i：DNA和RNA 螺旋酶超家族II j：DNA结合k：铁氧还蛋白l：疏水腔m：AP2/ERF家族n：生长素流入通透酶o：组蛋白家族p：浆膜。图2 不同处理条件下甜菜16W时期的差异基因的功能分类

注：A：氧化磷酸化代谢途径B：内质网中蛋白质的加工途径C：光合作用天线蛋白途径D：核糖体途径E：氨基糖和核苷酸糖代谢途径F：组氨酸的生物合成途径G：光合作用途径H：植物病原体相互作用途径I：光合生物体中的碳固定和碳代谢途径J：胞吞作用K：MAPK 信号途径 L：植物激素信号转导途径M：未表征的途径。 图3 不同处理条件下甜菜16 W时期差异基因的生物途径分析

3.4.2 不同处理条件下19 W时期叶片中差异基因分析

春化长日照、春化短日照、非春化长日照和非春化短日照19 W时期共得到86个差异片段，其中春化长日照28个、春化短日照17个、非春化长日照19个、非春化短日照22个。基因功能分类发现4个基因与组蛋白相关、7个基因与运输作用相关、4个基因与DNA结合作用相关、1个基因与赤霉素调节相关。基因的生物途径分析发现5个基因参与苯丙素生物合成和代谢途径、3个基因参与异喹啉生物碱生物合成和代谢途径、4个基因参与生物钟途径(图4)。

注：A：脱落酸生物合成和代谢途径B：氧化磷酸化和代谢途径C：氨酰-tRNA生物合成途径D：核糖体途径E：苯丙素生物合成和代谢途径F：氨基酸的生物合成途径G：光合作用和代谢途径H：光合作用天线蛋白途径I：谷胱甘肽代谢途径J：异喹啉生物碱的生物合成和代谢途径K：核黄素代谢途径L：淀粉和蔗糖代谢途径M：泛素介导的蛋白水解途径N：RNA运输途径O：昼夜节律P：未表征的途径。图4 不同处理条件下甜菜19 W时期差异基因的生物途径分析

3.4.3 不同处理条件下20W时期叶片中差异基因分析

春化长日照，春化短日照，非春化长日照和非春化短日照20 W时期的差异片段共117个，其中春化长日照现20 W时期32个、春化短日照42个、非春化长日照22个、非春化短日照21个。基因功能分类发现3个基因与跨膜作用相关、3个基因与催化作用相关、5个基因与运输作用相关、3个基因与磷酸合成酶相关、3个基因光合作用相关、6个基因与伸长因子相关。基因的生物途径分析发现3个基因参与淀粉和蔗糖代谢途径、3个基因参与鞘氨醇生物合成和鞘脂代谢途径、6个基因参与光合天线蛋白途径、3个基因参与谷胱甘肽代谢途径、5个基因参与氨基酸的生物合成途径、5个基因参与RNA运输途径、4个基因参与植物病原体相互作用途径见图5。

注：A：胞吞作用B：氨基糖和核苷酸糖代谢途径C：核糖体D：泛醌和其他萜类醌生物合成E：淀粉和蔗糖途径F：碳代谢途径G：鞘氨醇生物合成和鞘脂代谢途径H：光合天线蛋白质途径I：氨基酸的生物合成和碳代谢途径J：丝氨酸生物合成途径K：RNA聚合酶途径途径L：光合作用和代谢途径M：组氨酸生物合成途径N：谷胱甘肽代谢途径O：异喹啉生物碱生物合成途径P：氨基酸的生物合成途径Q：RNA运输途径R：植物病原体相互作用S：未表征的途径。图5 不同处理条件下甜菜芽期20W时期差异基因的生物途径分析

3.4.4 16 W和19 W时期叶片中差异基因的比较分析

不同处理条件下甜菜16 W时期差异基因63个、19 W时期86个，对16 W和19 W时期叶片中差异基因的功能分类发现二酮古洛糖酸还原酶、激活作用、DNA和RNA解旋酶超家族II、铁氧还蛋白、疏水腔、核酮糖二磷酸羧化酶、AP2/ERF家族、生长素流入通透酶、浆膜蛋白基因是16 W时期特有的；内质网中蛋白质的加工途径、氨基糖和核苷酸糖代谢途径、植物病原体相互作用途径、光合生物的碳固定和碳代谢途径、胞吞作用途径、MAPK信号通路途径、植物激素信号转导途径是16 W时期特有的。跨膜、磷酸合成酶、光依赖性、茉莉酸诱导和赤霉素调节蛋白基因是19 W时期特有的；β-胡萝卜素生物合成途径、氨酰-tRNA的生物合成途径、苯丙素生物合成途径、谷胱甘肽代谢途径、异喹啉生物碱生物合成途径、核黄素代谢途径、淀粉和蔗糖代谢途径、泛素介导的蛋白水解途径、RNA运输途径和生物钟调节途径是甜菜19 W时期特有的。

3.4.5 19 W和20 W时期叶片中差异基因的比较分析

不同处理条件下甜菜19 W和20 W时期差异基因比较分析，发现赤霉素调节蛋白基因是19 W时期特有的；脱落酸生物合成，β-胡萝卜素生物合成途径、氧化磷酸化和代谢途径、氨酰-tRNA的生物合成途径、苯丙素生物合成途径、异喹啉生物碱生物合成途径、核黄素代谢途径、泛素介导的蛋白水解途径、生物钟调节途径是甜菜19周时期特有的。伸长因子、跨膜氨基酸运输蛋白、原叶绿素酸酯还原酶和脂肪酸羟化酶相关基因是甜菜20 W时期特有的；胞吞作用、氨基糖和核苷酸糖代谢途径、泛醌和其它萜类醌生物合成和代谢途径、碳代谢途径、鞘氨醇生物合成和鞘脂代谢途径、氨基酸的生物合成和碳代谢途径、丝氨酸的生物合成途径、RNA聚合酶途径和植物病原体相互作用途径是甜菜20 W时期特有的。

3.4.6 春化相关基因分析

春化长日照甜菜16 W时期与非春化长日照甜菜16 W时期的差异基因比对分析，删除共有基因；春化短日照甜菜16 W时期与非春化短日照甜菜16 W时期的差异基因比对分析，删除共有基因，剩余58个基因为春化相关基因。春化相关基因的功能分类发现3个基因与ATP相关、6个基因与催化作用相关、3个基因与运输作用相关、4个基因与光合作用相关、3个基因与核酮糖二磷酸羧化酶蛋白质相关、1个基因与生长素运输作用相关，如图6所示。对春化相关基因的生物途径分类发现3个基因参与氧化磷酸化代谢途径、2个基因参与内质网中蛋白质的加工途径、4个基因参与光合作用和代谢途径、1个基因参与苯丙素生物合成和代谢途径、1个基因参与植物激素信号转导途径、34个基因的生物途径未知。

注：a：功能未知b：ATP相关c：催化作用d：DNA结合e：运输因子f：核糖体g：NADH-泛醌氧化还原酶h：磷酸乙酰葡糖胺变位酶i：光合作用j：激活位点k：F-box相关l：铁氧还蛋白m：疏水腔n：核酮糖二磷酸羧化酶o：生长素转运蛋白p：组蛋白家族q：浆膜蛋白。图6 春化相关基因的功能分类

3.4.7 光周期相关基因分析

春化长日照与春化短日照16 W时期甜菜叶片中的差异基因比对分析，非春化长日照与非春化短日照16 W时期叶片中的差异基因比对分析，结果为Ⅰ；春化长日照与春化短日照19 W时期甜菜叶片中的差异基因比对分析，非春化长日照与非春化短日照19 W时期甜菜叶片中的差异基因比对分析，结果为Ⅱ；将分析结果Ⅰ与分析结果Ⅱ再次进行比对分析，选出共有的差异基因，结果为Ⅲ；非春化长日照与非春化短日照20 W时期甜菜叶片中的差异基因比对分析，将20 W时期的分析结果与分析结果Ⅱ比对分析，选出共有的差异基因，结果为Ⅳ；将Ⅲ和Ⅳ再进行比对分析，筛选出21个光周期相关基因。功能分类发现3个基因与运输作用相关、2个基因与ATP相关。光周期相关基因的生物途径分类发现1个基因参与光合作用和代谢途径、1个基因参与脱落酸的生物合成和β-胡萝卜素的生物合成途径，如图7所示。

注：A：组氨酸生物合成途径B：丝氨酸的生物合成和碳代谢途径C：光合作用代谢途径D：脱落酸生物合成和β-胡萝卜素代谢途径E：氧化磷酸化和代谢途径F：核糖体途径G：未表征的途径。图7 光周期相关基因的生物途径分析

3.4.8 抽薹相关基因分析

春化长日照甜菜19 W时期的差异基因与春化长日照16 W时期的差异基因比对分析，去除共有的基因；春化短日照甜菜19 W时期的差异基因与春化短日照16 W时期的差异基因比对分析；春化短日照甜菜19 W时期的差异基因与非春化短日照19 W时期的差异基因比对分析；将三组比对分析的结果汇总，去除春化长日照与短日照16 W时期的差异基因和非春化短日照19 W时期的差异基因，最后得到甜菜抽薹相关基因共40个。抽薹相关基因的功能分类发现5个基因与DNA结合作用相关。抽薹相关基因的生物途径分类发现1个基因参与谷胱甘肽代谢途径、4个基因参与苯丙素生物合成和代谢途径、4个基因参与生物钟调节途径，如图8所示。

注：A：光合作用天线蛋白途径B：谷胱甘肽代谢途径C：异喹啉生物碱的生物合成和代谢途径D：核黄素代谢途径E：淀粉和蔗糖代谢途径F：RNA运输途径G：泛素介导的蛋白水解/Cul3-SPOP复合物H：苯丙素生物合成和代谢途径I：昼夜节律J：未表征的途径。图8 抽薹相关基因的生物途径分析

3.4.9 开花相关基因分析

春化长日照和短日照甜菜生长到19 W时期均出现抽薹性状，当春化长日照甜菜生长到20 W时出现开花表现型，而春化短日照甜菜在20 W时期只抽薹不开花，将春化长日照甜菜20 W时期的差异基因与春化短日照20 W时期差异基因比对分析，去除共有基因，再去除春化短日照20 W时期的差异基因，最后得到开花相关基因共30个，如表7所示。开花相关基因的功能分类发现6个基因与DNA结合作用相关。开花相关基因的生物途径分类发现2个基因参与淀粉和蔗糖代谢途径、3个基因参与鞘氨醇生物合成和鞘脂代谢途径，如图9所示。

表7 开花相关的差异条带编号，功能注释和染色体定位

续表7

注：A：氨基糖和核苷酸糖代谢途径B：核糖体途径C：泛醌和其他萜类醌生物合成途径D：淀粉和蔗糖代谢途径E：碳代谢途径F：鞘氨醇生物合成和鞘脂代谢途径G：光合作用天线蛋白途径H：未表征的途径。图9 开花相关基因的生物途径分析

4 结论

本文采用AFLP分子标记技术对春化长日照，春化短日照，非春化长日照和非春化短日照甜菜16 W、19 W和20 W三个发育时期叶片中的cDNA进行分子差异分析，获得如下结论：

(1)春化相关基因共58个。其中3个基因与ATP相关、6个基因与催化作用、3个基因与运输作用相关、4个基因与光合作用相关、3个基因与核酮糖二磷酸羧化酶蛋白质相关；生物途径分析发现3个基因参与氧化磷酸化和代谢途径、2个基因参与内质网中蛋白质的加工途径、2个基因参与光合天线蛋白途径、2个基因参与核糖体途径、4个基因参与光合作用途径、2个基因参与光合生物的碳固定和碳代谢途径、1个基因参与苯丙素生物合成和代谢途径、1个基因参与植物激素信号转导途径。

(2)光周期相关基因共21个。3个基因与运输作用相关、2个基因与ATP相关；生物途径分析发现1个基因参与组氨酸生物合成和代谢途径、1个基因参与丝氨酸生物合成和碳代谢途径、1个基因参与光合作用和代谢途径、1个基因参与脱落酸的生物合成和β-胡萝卜素生物合成途径、1个基因参与氧化磷酸化和代谢途径、1个基因参与核糖体途径。

(4)抽薹相关基因共40个。5个基因与DNA结合相关、2个基因与运输作用相关、2个基因与组蛋白相关、2个基因与跨膜蛋白相关；抽薹相关基因的生物途径分析发现1个基因参与谷胱甘肽代谢途径、2个基因参与异喹啉生物碱生物合成和代谢途径、2个基因参与核黄素代谢途径、1个基因参与淀粉和蔗糖代谢途径、4个基因参与苯丙素的生物合成和代谢途径、4个基因参与生物钟调节途径。

(5)开花相关基因共30个。2个基因与催化作用相关、2个基因与运输作用相关、6个基因与DNA结合作用相关；开花相关基因的生物途径分析发现2个基因参与氨基糖和核苷酸糖代谢途径、2个基因参与泛醌和其它萜类醌类生物合成途径、2个基因参与淀粉和蔗糖代谢途径、2个基因参与碳代谢途径、3个基因参与鞘氨醇生物合成和鞘脂代谢途径。

致谢：

感谢“国家科技技术基础平台-国家地球系统科学数据共享平台-东北黑土科学数据中心(http://northeast.geodata.cn)”提供数据支撑。