添加醪糟益生菌发酵香肠工艺条件的筛选

佳木斯大学生命科学学院 黑龙江佳木斯 154007

随着人们的生活水平日益提高，肉类食品已逐渐成为人们饮食结构中重要的组成部分，尤其是香肠制品由于方便、快捷、口感好深受人们喜爱[1]。传统香肠的制作工艺，需要添加亚硝酸盐。亚硝酸盐虽然能够起到发色、抗氧化、改善质构和抑菌等作用[2]，但亚硝酸盐能与肉中蛋白质的分解产物胺类反应，生成具有强烈致癌作用的亚硝胺[3]。随着人们健康意识的增强，降低香肠中亚硝酸盐的含量、提高食品安全性、生产更具营养价值的香肠已迫在眉睫[4，5]。

益生菌在发酵香肠生产领域的研究比较广泛，具有代替和降解亚硝酸盐的作用[6，7]。在发酵过程中，益生菌还能逐渐消耗肉中残存的氧气，从而降低氧化还原电势，防止肉的腐烂和酸败，同时赋予食品柔和的酸味和香气，改进食品的品质和营养，促进发酵香肠的成熟[8]。大量研究表明，不同乳酸菌在发酵肉制品过程中的作用效果和功能不同，且多菌种比单一菌种发酵效果好，亚硝酸盐降解率高[9～11]。目前多菌种发酵香肠的研究虽有报道，但添加醪糟益生菌发酵香肠的研究尚未见报道。醪糟口味香甜醇美，含酒精量极低，富含维生素、葡萄糖、氨基酸等营养成分，有活气养血、滋阴补肾、温寒补虚、促进血液循环等功效[12]，其中的营养成分亦有助于益生菌的生长与代谢。添加醪糟旨在辅助益生菌降解亚硝酸盐，同时提升香肠的风味、营养价值与保健功效。本试验以多菌种复配为发酵剂，并在发酵过程中添加醪糟，探究发酵温度、益生菌接种量、发酵时间、醪糟添加量对香肠中亚硝酸盐降解率和香肠感官品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 原料

鸡胸肉、牛肉、淀粉、花椒、胡椒粉、食盐、奶粉购买于佳木斯超市；

益生菌混合发酵剂由佳木斯大学发酵工程试验室提供；

三聚磷酸钠、亚硝酸盐均为食品级。

1.1.2 试剂

饱和硼砂：分析纯，哈尔滨化工化学试剂厂。

亚铁氰化钾：分析纯,天津市致远化学试剂有限公司。

乙酸锌：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

对氨基苯磺酸：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司。

盐酸萘乙二胺：分析纯，天津光复精细化工研究所。

亚硝酸盐：分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司。

冰乙酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

盐酸：分析纯，新海乳溶厂。

1.1.3 仪器

SPX-250B—Z型生化培养箱、YXQ—LS—75SⅡ立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；

JP—040S超声波振荡器，深圳市洁盟清洗设备有限公司；

SpectrumLab22pc可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；

HH—Z2型恒温水浴锅，郑州长城科工贸有限公司；

SW—CJ—2FD标准型净化工作台，苏州安泰空气技术有限公司；

AB104-S分析天平，METTLER TOLEDO Made in Switzerland；

HWS—250B恒温恒湿箱，杭州艾普仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 香肠发酵工艺流程及操作要点

(1)工艺流程。

鸡肉和牛肉→绞碎→加调味料→混匀→加醪糟、接种益生菌→混匀→灌装→发酵→熟化。

(2)操作要点。

将肠衣先用温水浸泡20min，然后放流水下冲洗，使其脱盐，备用；灌肠时一定要松紧适度，使香肠均匀饱满，不能过松或者过紧；香肠灌制完成后，在温水中轻轻漂洗，洗去肠衣上附着的污物；把灌好的半成品香肠置于恒温恒湿培养箱中发酵(湿度均设置为95%)；把肉灌进肠衣后，用牙签均匀的扎几个小孔，排除肉里面的空气，并且有利于肠内的水分蒸发；于70℃恒温蒸煮锅熟化30min，冷却，指标测定。

1.2.2 香肠的配方

肉100g、淀粉5g、亚硝酸盐15mg、胡椒粉0.2g、蒜5g、三聚磷酸钠0.2g、盐2g。

1.2.3 培养基及菌种活化

(1)活化培养基(1L)。

奶粉20g，蔗糖30g，用浓度为5%的豆浆定容至1 000mL，121℃灭菌15min。

(2)菌种的活化。

无菌操作，将保存的液体菌种按6%的接种量接入活化培养基中，封口，放入恒温培养箱中37℃活化培养48h，备用。

1.2.4 醪糟的制作及预处理

(1)醪糟的制作。

糯米→浸泡(24h)→蒸煮(隔水、110℃、30min)→冷却→接种甜酒曲→保温发酵(28℃、72h)→后熟(48h)。

(2)醪糟的预处理。

醪糟使用前用打浆机打成浆状。

1.2.5 单因素试验

(1)发酵温度。

益生菌接种量为10%(以100g肉计)，醪糟添加量为15%，将半成品香肠分别置于20、25、30、37℃,4组温度下进行发酵，发酵时间为24h，取出，熟化，进行感官评价并测定亚硝酸盐含量。各组做3个重复，结果取平均值。

(2)发酵时间。

益生菌接种量为10%，醪糟添加量为15%，将半成品香肠置于30℃的培养箱中，分别发酵6、12、18、24、36h，取出，熟化，进行感官评价并测定亚硝酸盐含量。各组做3个重复，结果取平均值。

(3)益生菌接种量。

（1）戊申將軍範伯陽，庚申將軍華文陽，戊戌將軍範少卿。（《太上說玄天大聖真武本傳神呪妙經註》卷一，《中华道藏》30/538）1 30/538表示第30册，第538页。

醪糟添加量为15%，益生菌接种量分别为3%、5%、7%、10%，为了使香肠的水分活度一致，每组的加水量为(10%-接种量)×90%，置于30℃培养箱中发酵24h，取出，熟化，进行感官评价并测定亚硝酸盐含量。各组做3个重复，结果取平均值。注：90%为活化培养基的含水量。

(4)醪糟添加量。

益生菌接种量为10%，醪糟添加量分别为10%、15%、20%、30%，为了使香肠的水分活度一致，每组的加水量为(30%-醪糟添加量)×70%，置于30℃的培养箱中发酵24h，取出，熟化，进行感官评价并测定亚硝酸盐含量。各组做3个重复，结果取平均值。注：70%为醪糟的含水量。

1.2.6 正交试验

在单因素试验结果的基础上，对添加醪糟益生菌发酵香肠工艺进一步优化。以降解率和感官评价为考量指标，对发酵温度、益生菌接种量、发酵时间、醪糟添加量进行4因素3水平L9(34)正交试验。各组做3个重复，结果取平均值。正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验方案

1.2.7 指标测定

(1)亚硝酸盐残留量的测定。

参照GB 5009.33—2016中分光光度法测定样品中亚硝酸盐含量[13]。图1为亚硝酸盐标准曲线。

(2)亚硝酸盐降解率的计算。

X1——试样中亚硝酸钠的含量(mg/kg)；

100.93——加入150mg/kg食品级亚硝酸盐的香肠未发酵前测得亚硝酸盐的含量(mg/kg)。

(3)感官评价。

组织10位志愿者对香肠进行品尝，按表2感官评价评分细则进行打分，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 发酵温度

由图2可知，随着发酵温度的升高，亚硝酸盐的降解率逐渐增大，说明升高温度对益生菌降解亚硝酸盐有促进作用，30℃与37℃时降解率较高；随着发酵温度的升高，感官评价得分呈正态分布，温度为30℃时得分最高，此时香肠表面光滑、肉质细腻，弹性好，颜色肉粉、有光泽，发酵香味适宜、有食欲；温度为37℃时香肠肉质略粗糙，弹性较弱，色泽与风味欠佳；温度低于30℃，香肠弹性、色泽、风味均不及30℃好。综合亚硝酸盐的降解率和感官评价得分，发酵温度30℃为宜。

表2 益生菌发酵香肠感官评价表

2.1.2 发酵时间

由图3可知，随着发酵时间的延长，亚硝酸盐的降解率逐渐增大，时长对降低亚硝酸盐有正向影响，24h与36h时降解率较高；随着发酵时间的延长，感官评价得分先升高后降低，24h时得分最高，此时香肠肉质细腻、切面平整，弹性好，颜色肉粉、有光泽，发酵香味适宜、有食欲；与发酵时间为24h的香肠相比，其他发酵时间的香肠弹性不足，肉质略粗糙、切面有孔隙，口感欠佳。综合亚硝酸盐的降解率和感官评价得分，发酵时间24h为宜。

2.1.3 益生菌接种量

由图4可知，随着益生菌接种量的增加，亚硝酸盐的降解率逐渐增大，接种量为7%、10%、15%时，降解率增加不多；益生菌接种量由3%到15%时，感官评价得分逐渐增高，但分值相差不显著。益生菌接种量不断增加会导致生产成本大幅度提高，综合考虑经济因素、亚硝酸盐的降解率和感官评价得分，益生菌接种量10%为宜。此时香肠表面光滑、肉质细腻、切面平整，弹性好，有光泽，发酵味较适宜。

2.1.4 醪糟添加量

由图5可知，随着醪糟添加量的增加，亚硝酸盐的降解率和感官评价得分均呈正态分布。当醪糟添加量为15%时，亚硝酸盐的降解率和感官评价得分均最高，此时香肠肉质细腻，颜色肉粉、有光泽，且发酵风味最佳；醪糟添加量过高，则香肠肉质粗糙，颜色偏白、光泽度降低；不添加醪糟或添加量过低，香肠的风味与口感不足。所以综合亚硝酸盐的降解率和感官评价得分，醪糟添加量15%为宜。说明发酵香肠中添加适量醪糟，可以提高亚硝酸盐的降解率，改善香肠的风味口感。

2.2 正交试验结果与分析

2.2.1 降解率结果分析

正交试验结果见表3。

表3 L9(34)正交试验结果

由表3可知，通过比较R值RA>RC>RB>RD，4个因素对香肠亚硝酸盐降解率的影响为：发酵温度影响最大，其次为发酵时间、益生菌接种量，醪糟添加量影响最小。

A因素列：K3>K2>K1。B因素列：K3>K1>K2。C因素列：K3>K2>K1。D因素列：K2>K3>K1。由此可以得出正交试验优化的组合为A3B3C3D2(Y1)，即温度30℃,益生菌接种量10%，时间24h，醪糟添加量15%降解率最大。

由表3直接得知：4号组合A3B1C3D2(Z1)降解率最高，即温度30℃，益生菌接种量6%，时间24h，醪糟添加量15%。

2.2.2 感官评价结果分析

将9组香肠置于70～75℃的恒温锅中，熟化30min，冷却至室温，从组织状态、弹性、色泽、风味等方面进行感官评价，评价结果如表3。

由表3可知，通过比较R' 值RA'>RB'>RD'>RC'，4个因素对发酵香肠感官的影响为：发酵温度影响最大，其次为益生菌接种量、醪糟添加量，发酵时间影响最小。

A因素列：K2'>K3'>K1'。B因素列：K3'>K2'>K1'。C因素列：K3'>K2'>K1'。D因素列：K3'>K2'>K1'。由此可以得出正交试验优化的组合为A2B3C3D3(Y2)，即温度26℃，益生菌接种量10%，时间24h，醪糟添加量18%得分最高。

由表3直接得知：6号组合A2B3C1D2(Z2)得分最高，即温度26℃，益生菌接种量10%，时间15h，醪糟添加量15%。

2.3 验证性试验结果

对正交试验得出较好的4个组合，即Y1(A3B3C3D2)、Z1(A3B1C3D2)、Y2(A2B3C3D3)、Z2(A2B3C1D2)，做对比验证试验，结果如图6。

由图6可知，比较四组的降解率，最高为Y1组，最低为Z2组；比较四组的感官评价得分，最高为Z2组，其次为Y1组。比较Y1组与Z2组，虽然Z2组的感官评价得分高于Y1组，但Z2组的降解率最低。因此最佳组合为Y1组，即发酵温度为30℃，益生菌接种量为10%，时间为24h，醪糟添加量为15%时，亚硝酸盐的降解率高，且香肠表面光滑、肉质细腻、切面平整，弹性好，颜色肉粉、有光泽，发酵香味适宜、有食欲。

3 讨论与结论

本文通过单因素试验和正交试验，探究了发酵温度、发酵时间、益生菌接种量和醪糟添加量对发酵香肠感官及亚硝酸盐降解率的影响。得出发酵温度30℃、发酵时间24h、益生菌接种量10%、醪糟添加量15%时，亚硝酸盐的降解率高，香肠的感官品质好。

通过对比添加醪糟与未添加醪糟的发酵香肠，说明添加醪糟不仅对提高香肠的硬度、咀嚼性、弹性、色泽，改善发酵香肠的风味质量有一定的作用，同时对益生菌降解亚硝酸盐有促进作用。

加水量对亚硝酸盐的降解率及香肠的口感、组织状态均有影响，进行单因素试验和正交试验时，由于益生菌接种量和醪糟添加量不同，带入的水分不同，为了使香肠的水分活度一致，按比例添加了不同量的无菌水，避免水分活度不一致对试验结果产生影响。同时，进行温度与时间的单因素试验时发现，发酵温度过高、时间过长，会导致未熟化肠衣表面发黏，产生不良发酵气味，出现颜色发白等现象。所以混合菌发酵香肠的发酵温度不宜过高，发酵时间不宜过长。