夏枯草不同超声时间后熊果酸和齐墩果酸的含量变化

2019-12-10 10:22向润清黄宽张艳娇
云南中医中药杂志 2019年11期
关键词:夏枯草

向润清 黄宽 张艳娇

摘要:目的测定并分析夏枯草不同超声时间后其同分异构体熊果酸和齐墩果酸的含量变化。方法采用Thermo Acclaim C30(150 mm×21 mm,3 μm),流动相为乙腈-02%乙酸水溶液(85:15),等度洗脱,检测波长205 nm,柱温18℃,流速为03 mL/min,测定熊果酸、齐墩果酸的含量变化。结果夏枯草中熊果酸在08~48 μg范围内呈线性关系,相关系数达到09997;齐墩果酸在096~576 μg范围内呈线性关系,相关系数为09995。夏枯草中的熊果酸及齐墩果酸在超声时间为60 min时含量均最高。结论本实验以超声时间对夏枯草中同分异构体熊果酸和齐墩果酸含量的变化做出研究,随着超声时间的延长,两者含量均逐步升高,这为夏枯草中部分五环三萜类成分的提取、分离、鉴定、制备提供一定的参考。

关键词:夏枯草;熊果酸;齐墩果酸;同分异构体

中图分类号:R9272文献标志码:A文章编号:1007-2349(2019)11-0074-04

Content Changes of Ursolic Acid and Oleanolic Acid in Prunella vulgaris L. after Different Ultrasonic Time

XIANG Run-qing1, HUANG Kuan1, ZHANG Yan-jiao1, FAN Yuan2

(1. School of Traditional Chinese Materia Medica, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China; 2. The Second Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650216, China)

【Abstract】Objective: To determine and analyze the content changes of isomers ursolic acid and oleanolic acid in Prunella vulgaris L. after different ultrasonic time. Methods: Thermo Acclaim C30 (150 mm × 2.1 mm, 3 μm) was used and mobile phase was acetonitrile-0.2% aqueous acetic acid (85:15), with isocratic elution, detection wavelength 205 nm, column temperature 18° C and flow rate 0.3 mL/min. The content changes of ursolic acid and oleanolic acid was determined. Results: The ursolic acid in Prunella vulgaris L. showed a linear relationship in the range of 0.8 to 4.8 μg, and the correlation coefficient was 0.9997. The oleanolic acid showed a linear relationship in the range of 0.96 to 5.76 μg, and the correlation coefficient was 0.9995. The content of ursolic acid and oleanolic acid in Prunella vulgaris was highest at 60 min. Conclusion: In this experiment, the content changes of the isomers ursolic acid and oleanolic acid in Prunella vulgaris L. were studied by ultrasonic time. With the prolongation of ultrasonic time, the content of both were gradually increased. The study provides a certain reference for the extraction, separation, identification and preparation of some of the five-ring triterpenoids.

【Key words】Prunella vulgaris L., ursolic acid, oleanolic acid, isomeride

夏枯草為唇形科(Lamiaceae)植物夏枯草Prunella vulgaris L的干燥果穗,始载于《神农本草经》,主要分布于云南、四川、贵州、湖北、湖南等地,其中硬毛夏枯草主产于云南,且被《云南省药品标准》收载。夏枯草味苦、辛,性寒,归肝、胆经,具有清火、明目、消肿、散结等功效,常用于治疗目珠夜痛、目赤肿痛、头痛眩晕、瘿瘤、瘰疬、乳癖、乳痈、乳房胀痛等病症[1]。现代药理学研究表明夏枯草具有降糖[2]、降压[3]、抗菌消炎、免疫调节作用[4]、抗氧化作用[5]、抗肿瘤、抑制病毒生长等[6-7]多种药理作用,对目赤肿痛、畏光流泪、目珠夜痛、头晕目眩、瘰疬、瘿瘤、乳腺癌、高血压、淋巴结核、浸润性肺结核、单纯性甲状腺肿、腮腺炎、急性黄疸型传染性肝炎等多种疾病均有良好的临床治疗效果[8-9]。夏枯草中主要含有三萜及其苷类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、苯丙素、有机酸、挥发油及糖类等成分,其中以三萜类成分为主,主要类型为齐墩果烷型、乌苏烷型和羽扇豆烷型,以齐墩果酸和熊果酸含量最高[10]。熊果酸与齐墩果酸互为同分异构体,分子式均为C30H48O3,熊果酸分子量:45668 g/moL,齐墩果酸分子量:45671 g/moL,二者的化学结构区别在于熊果酸在19和20位碳原子上各有一个甲基,而齐墩果酸的20位碳原子上有2个甲基,在19位碳原子上无甲基。因此,两种天然化合物的理化性质相似(两者结构式见图1)。

熊果酸(ursolic acid UA),又名乌索酸、乌苏酸,以游离形式或与糖结合成苷,是夏枯草中的主要化学成分之一,熊果酸具有广泛的生物学特性,通常用于抗菌、抗病毒、抗肿瘤和保肝等[11-13]治疗,如UA在HEPG2、7721和Huh7人肝癌细胞系中,可降低转录激活因子3(STAT3)的下游靶基因(例如Bcl-2,Bcl-xl)的表达,抑制肿瘤生长[14];齐墩果酸(Oleanolic acid OA)为齐墩果烷型五环三萜类化合物,具有保肝、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等多种药理作用[15-18],如OA作用于K562细胞后,可以增加其Bax mRNA的水平,降低Bcl-xL mRNA的水平,从而调整Bcl-2家族相关凋亡蛋白表达的比例来诱导癌细胞的凋亡[19]。

本实验根据夏枯草中五环三萜类成分同分异构体熊果酸和齐墩果酸的理化性质,应用Thermo Acclaim C30色谱柱,测定夏枯草中熊果酸和齐墩果酸在不同超声时间下含量的变化。

1材料与仪器

11材料乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)均购自默克化工技术(上海)有限公司、乙酸(分析纯)、甲醇(分析纯)均购自天津市风船化学试剂科技有限公司,纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司),熊果酸标准品(四川省维克奇生物科技有限公司,批号:wkq181217),齐墩果酸标准品(四川省维克奇生物科技有限公司,批号:wkq181026),夏枯草果穗(云南罗平,批号:P20180930)。

12仪器Agilent 1200 高效液相色谱仪(VWD检测器),FA1004N 型万分之一分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司),语路超声波清洗机、DFY-600 摇摆式高速万能粉碎机(永康式速锋工贸有限公司),T-1000 型电子天平(上海浦春计量仪器有限公司),D2KW-D 电热恒温水浴锅。

2方法与结果

21夏枯草粉末的制备干燥的夏枯草果穗,用打粉机打碎,过40目筛即得。

22熊果酸和齐墩果酸混合对照品溶液的制备精密称定熊果酸对照品40 mg,齐墩果酸对照品48 mg置10 mL容量瓶中,加入甲醇定容,制成熊果酸和齐墩果酸浓度分别为04 mg·mL-1、048 mg·mL-1的溶液,备用。

23供试品溶液的制备精密称取夏枯草粉末约10 g分别置于5个带塞锥形瓶中,分别加入20 mL甲醇,密塞,超声处理20、30、40、50、60 min后取出,放冷,摇匀,过滤,取滤液,过045 μm微孔滤膜,即得供试品溶液,备用。

24色谱条件色谱柱:Thermo Acclaim C30(150 mm×21 mm,3 μm),流动相为乙腈-02%乙酸水溶液(85:15),等度洗脱,检测波长205 nm,柱温18℃,流速为03 mL/min,进样量:10 μL。

25熊果酸、齐墩果酸对照品、夏枯草供试品溶液的高效液相色谱(HPLC)图谱分别见图2~3(A:齐墩果酸,B:熊果酸)。

26线性关系考察

261标准曲线的绘制取“22”项下的标准对照品溶液,经045 μm的微孔滤膜过滤后,按“24”项下色谱条件分别取2、4、6、8、10、12 μl进样,以进样量X(μg)为横坐標,峰面积Y(mAU *s)为纵坐标,绘制标准曲线,得到熊果酸、齐墩果酸的回归方程分别为:y=18744x-13911,R2=09997;y=y=23405x-20622,R2=09995,结果表明,熊果酸、齐墩果酸分别在08~48 μg,096~576 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,见图4~5。

262精密度考察取“22”项下的混合对照品溶液10 μL,按“24”项下色谱条件连续进样6次,按峰面积计算熊果酸、齐墩果酸的RSD值分别为:161%、161%,表明仪器精密度良好。

263稳定性考察取“23”项下超声30 min的夏枯草样品溶液,按“24”色谱条件,分别在0,2,4,6,8,10 h进样,分别计算熊果酸、齐墩果酸峰面积的RSD值为:036%、072%,夏枯草提取液在10 h内稳定。

264重复性试验准确称取夏枯草粉末6份,按“23”项下相同方法制得夏枯草超声30 min的提取液,按“24”项下的色谱条件,每份进样10 μL,以熊果酸、齐墩果酸峰面积计算,其峰面积RSD值分别为071%、084%,表明样品重复性良好。

27夏枯草不同超声时间后熊果酸和齐墩果酸的含量变化见表1和图6。

3讨论

31实验结果从表1、图6的结果中看出:在线性范围内,熊果酸和齐墩果酸的含量均随着超声时间的延长而升高,熊果酸含量在20 min~40 min之间变化比较平缓,40 min~50 min之间含量变化趋势最大,50 min~60 min之间熊果酸含量几乎不变;齐墩果酸含量在20 min~40 min之间变化趋势比较平缓,40 min~50 min之间含量变化趋势较大,但没有熊果酸的变化趋势大,50 min~60 min之间齐墩果酸含量也几乎不变,趋于稳定,即两种成分含量在相同时间段内变化趋势一致。

32色谱柱和流动相洗脱程序的选择本实验先后考察了Agilent ZORBAX SB-C18(46 mm×250 mm,5 μm)和Thermo Acclaim C30(150 mm×21 mm,3 μm)色谱柱,以及流动相乙腈-乙酸水溶液(01-05%)、乙腈:磷酸水溶液(01-05%)的比例变化,最后发现用色谱柱Thermo Acclaim C30(150 mm×21 mm,3 μm),流动相为乙腈-02%乙酸水溶液(85:15)的条件下,更有利于同分异构体熊果酸和齐墩果酸两种成分的分离。

4结论

本实验运用RP-HPLC法测得夏枯草中同分异构体熊果酸和齐墩果酸均随著超声时间的延长而增加,含量变化趋势一致,且在60 min时含量最高,以上结果提示:中药材中同分异构体类成分的含量可能随着超声时间的一定延长而逐步升高,且相同时间段呈现出相同的变化趋势。本实验为夏枯草和其他中药材中五环三萜类成分的提取、分离、鉴定、制备提供一定的参考。

参考文献:

[1]国家药典委员会中国药典2015年版.北京:化工出版社,2015:280

[2]Raafat K,Wurglics M,Schubert-Zsilavecz MPrunella vulgaris Lactive components and their hypoglycemic and antinociceptive effects in alloxan-induced diabetic mice[J].Biomedicine & Pharmacotherapy,2016,84:1008-1018

[3]Zhang W,Fan JM,Tang Y,et alStudies on Characterization of Active Constituents in Prunella vulgaris Land Mechanism of their Antihypertensive Effect[J].Asian Journal of Chemistry,2014,26(18):5967-5969

[4]Lu J,Qin R,Ye S,et alPrunella vulgaris Lextract improves cellular immunity in MDR-TB challenged rats[J].Journal of Medical Colleges of PLA,2011,26(4):230-237

[5]Chen Y,Zhang X,Guo Q,et alPlant morphology,physiological characteristics,accumulation of secondary metabolites and antioxidant activities of Prunella vulgaris,Lunder UV solar exclusion[J].Biological Research,2019,52(1):2-12

[6]Li C,Huang Q,Xiao J,et alPreparation of Prunella vulgaris polysaccharide-zinc complex and its antiproliferative activity in HepG2 cells[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,91:671-679

[7]Oh C S,Price J,Brindley M A,et alInhibition of HIV-1 infection by aqueous extracts of Prunella vulgaris L[J].Virology Journal,2011,8(1):188-188

[8]孙宬夏枯草的药理作用和研究进展[J].中医临床研究,2016(26):146-148

[9]赵秀梅中药夏枯草的药理作用研究现状[J].内蒙古中医药,2016(12):120-122

[10]Gu X,Li Y,Mu J,et alChemical constituents of Prunella vulgaris[J].Environ Sci,2013(1):161-163

[11]Mu D,Zhou G,Li J,et alUrsolic acid activates the apoptosis of prostate cancer via ROCK/PTEN mediated mitochondrial translocation of cofilin-1[J].Oncology Letters,2018,15(3):3202-3206

[12]Meng Y,Lin Z M,Ge N,et alUrsolic Acid Induces Apoptosis of Prostate Cancer Cells via the PI3K/Akt/mTOR Pathway[J].The American Journal of Chinese Medicine,2015,43(7):1471-1486

[HJ1.9mm][SD1,1][FQ(12*2。175mm,X,DY-W][CD=175mm]

[13]张男男,戈娜熊果酸对实验性肝损伤的保护作用研究进展[J].华夏医学,2018,31(4):173-177

[14]Liu T,Ma H,Shi W,et alInhibition of STAT3 signaling pathway by ursolic acid suppresses growth of hepatocellular carcinoma[J].International Journal of Oncology,2017,51(2):555-562

[15]Akl M R,Elsayed H E,Ebrahim H Y,et al3-O-[N-(p-fluorobenzenesulfonyl)-carbamoyl]-oleanolic acid,a semisynthetic analog of oleanolic acid,induces apoptosis in breast cancer cells[J].European Journal of Pharmacology,2014,740:209-217

[16]张明发,沈雅琴齐墩果酸和熊果酸保肝药理作用的研究进展[J].抗感染药学,2012,9(1):13-19

[17]蒋惠娣齐墩果酸体外对感染HIV的人单核细胞的抗病毒作用[J].现代药物与临床,2003,18(1):24-24

[18]Mu D W,Guo H Q,Zhou G B,et alOleanolic acid suppresses the proliferation of human bladder cancer by Akt/mTOR/S6K and ERK1/2 signaling[J].International Journal of Clinical & Experimental Pathology,2015,8(11):13864-13870

[19]Liese J,Abhari B A,Fulda SSmac mimetic and oleanolic acid synergize to induce cell death in human hepatocellular carcinoma cells[J].Cancer Letters,2015,365(1):47-56

(收稿日期:2019-07-19)

猜你喜欢
夏枯草
夏枯草清凉解渴又降压
清肝明目夏枯草
夏枯草的妙用
功效卓著的夏枯草
夏枯草治好了我的咽炎
夏枯草:清肝降火之草
夏枯草高效种植技术
清肝散结夏枯草
夏天清热,离不开夏枯草
清肝散结夏枯草