小建中汤激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路抗小鼠运动性疲劳的作用

郝佳梦 周庆莹 陈章风 李予煊 闫晓博 郭军鹏 刘宏岩

(1河北医科大学，河北 石家庄 050017；2长春中医药大学)

疲劳是机体复杂的生理变化过程，其发生机制目前尚没有统一的定论〔1，2〕。氧自由基-脂质过氧化学说认为：运动等应激过程可产生大量氧自由基，中等至高浓度的自由基堆积可导致细胞线粒体膜脂质过氧化并产生氧化应激反应，从而促使细胞凋亡甚至坏死〔3，4〕，导致疲劳无法缓解，同时还可加速机体衰老过程〔5〕。因此，清除自由基、抗脂质过氧化是抗疲劳且防止疾病发生的途径之一。《金匮要略·血痹虚劳病》篇中“虚劳病”和现代医学的“疲劳”概念有相似之处，小建中汤为其中治疗劳力过度所致虚劳里急的代表方剂。该方调和阴阳，和里缓急，能够治疗阴液耗损过多所导致的虚劳里急证候，临床治疗疲劳病症效果显著〔6〕。本实验探讨小建中汤抗小鼠运动性疲劳功效及其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级雄性昆明小鼠60只，体重(20±2)g，由长春市易思实验动物技术有限责任公司提供，许可证号：SCXK(吉)2016-0003，适应性饲养3 d。

1.2药物与试剂 小建中汤：桂枝、白芍、炙甘草、生姜、大枣、饴糖。按人∶小鼠=1∶10换算小鼠用药量。上方定为中剂量组，将剂量的三分之一和三倍作为低剂量和高剂量组，各组给药量分别为0.58、1.75、5.25 mg/kg。煎煮时将除饴糖外药材以8倍体积水浸泡0.5 h，文火0.5 h，后纳胶饴，取液备用；二煎以6倍体积水，两次煎液合并后浓缩。四君子汤：人参、白术、茯苓、甘草，煎煮方法同上。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(20170720G)、超氧化物歧化酶(SOD)(20170612)、丙二醛(MDA)(20170610)试剂盒购自北京华英生物工程研究所；一抗GAPDH、Keap1、转录因子-E2相关因子(Nrf)2、二抗辣根过氧化物酶(HRP)购于Proteintech公司。

1.3仪器 M200PRO型酶标仪(TECAN公司中国)，Omega Lum G型化学发光凝胶成像仪(Aplegen公司)。

1.4负重游泳筛选 小鼠负重游泳，选取出现力竭状态时间相近的48只小鼠。力竭标准：小鼠在水中旋转，动作的协调性显著降低，身体不能维持在水平面反复浮沉，至再次浮出水面的时间超10 s，被提起后无反抗挣扎。

1.5分组及给药 将小鼠随机分为正常组(C)、模型(M)组、小建中汤低剂量(SL)组、小建中汤中剂量(SM)组、小建中汤高剂量(SH)组、四君子汤(JZ)组，每组8只。C和M组按200 mg/(kg·d)给予生理盐水，中药各组按相应比例灌服小建中汤和四君子汤，给药1 h后力竭游泳训练，连续10 d。

1.6样本采集及检测 记录每次力竭游泳时间。第10天游泳后，取双侧股四头肌冻存备用。取骨骼肌100 mg，研磨，3 500 r/min离心15 min，取上清液，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测GSH-Px、SOD、MDA含量。

1.7Western印迹实验方法 取肌肉组织50 mg，加入1 ml放射免疫沉淀(RIPA)裂解液研磨组织，冰上裂解30 min，随后4℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清备用。配置凝胶，进行垂直电泳，转膜120 min。放入5%脱脂奶粉封闭60 min，加入一抗，4℃过夜，二抗孵育60 min。采用电化学发光(ECL)法进行蛋白显色，用Gelpro32软件对显色条带灰度值进行定量分析，以目的蛋白和内参蛋白灰度比值作为统计结果。

1.8统计方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组游泳时间 与M组〔(150±7.09)s〕相比，SL、SM、SH、JZ组均可显著延长小鼠力竭游泳时间〔(217±11.90)、(193±13.12)、(217±17.77)、(184.27±15.24)s，P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.05〕。

2.2各组股四头肌GSH-Px、SOD、MDA水平 与C组比较，M组GSH-Px、SOD含量显著下降(P<0.01，P<0.05)，MDA含量显著增多(P<0.05)。与M组相比，GSH-PX、SOD含量以SL、SH组、JZ组变化显著(P<0.01)；MDA含量以SL、SM、SH组变化显著(P<0.01，P<0.01,P<0.05)，JZ组未见显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组GSH-Px、SOD、MDA水平

与C组相比，1)P<0.05，2)P<0.01；与M组相比，3)P<0.05，4)P<0.01

2.3各组股四头肌Keap1和Nrf2蛋白表达 与C组(1.00±0.03)相比，M组Keap1蛋白表达(1.12±0.02)显著上升(P<0.05)。与M组相比，SL、SH和JZ组Keap1蛋白(0.97±0.04、1.04±0.03、0.61±0.03)显著降低(P<0.05)，SM组为(1.11±0.03)，无显著差异(P>0.05)。在Nrf2蛋白表达方面， M组(0.38±0.06)较C组(1.18±0.08)明显下降(P<0.01)；与M组相比，SL、SM、SH组Nrf2蛋白表达量(1.00±0.01、0.68±0.02、0.77±0.03)均明显提高(均P<0.05)，JZ组(0.40±0.06)无显著差异(P>0.05)。见图1。

图1 各组股四头肌Keap1和Nrf2表达

3 讨 论

疲劳属于中医的虚劳病。《金匮要略》中的虚劳病篇以桂枝汤加减的汤剂——小建中汤、黄芪建中汤、桂枝加龙骨牡蛎汤作为抗疲劳的方剂。虚劳病的病因为劳伤过度〔7〕，继而耗伤人体的气血阴阳，结果导致阴阳失和、气血失常而疲劳。因此认为，虚劳病的病机乃是阴阳失和、气急逆乱，并非脏腑亏虚、阴阳不足〔8〕。基于此，仲景治疗虚劳是采用调和营卫的方法，通过调和营卫来调和逆乱的气血阴阳。小建中汤为虚劳病中治疗劳力过度所致虚劳里急的代表方剂，汤证所列症状包括“悸，衄，腹中痛，梦失精，四肢痠疼，手足烦热，咽干口燥”，与急性劳伤所致的疲劳状态较为相似，基本病机是由于急性劳伤而汗液大出，造成卫阳之气被郁、营阴津液不敛，从而形成机体阴阳失和、气机逆乱的证候。该方桂枝、白芍相配，一辛一酸、一阴一阳、一散一敛，使卫气宣发、营阴内敛，芍药加倍更增酸甘化阴、缓急止痛之功；生姜兼能发散，大枣补脾和胃；甘草、桂枝相合辛甘化阳以通卫，甘草、白芍相合酸甘化阴以和营；饴糖滋养阴液，以助汗源，诸药合力平调阴阳，调和气血。气血和则生机有源，对于阴阳失调、气血失和导致的虚劳里急病症具有确切疗效。

一些学者认为疲劳是“气虚”证，所谓“少气不足以息则倦怠无力”，并且“劳则气耗，劳则喘息汗出”劳倦过度可以导致气耗而虚，因而治疗时常采用补气健脾方来补虚抗劳。四君子汤作为补气经典方剂，在研究中显示其能够减少力竭小鼠运动后血清乳酸含量、提升肝糖原、肌糖原含量，改善免疫器官脏器指数〔9，10〕，具有提高机体运动能力的作用。

目前对于Keap1-Nrf2-ARE信号通路的研究十分广泛〔11，12〕。生理状态下，Nrf2主要与Keap1结合，经泛素化作用分解，以保持在生理状态下的低转录活性〔13〕。当细胞受到氧自由基(ROS)或其他亲核基团刺激后，Nrf2与 Keap1解耦联，活化的 Nrf2转运进入细胞核，与抗氧化反应元件(ARE)相结合，下游Ⅱ相代谢酶和抗氧化酶SOD、GST-Px等的表达被激活，调节体内氧化平衡，有效清除自由基和其他氧化代谢产物〔14，15〕，发挥抗氧化损伤作用〔16〕，保护机体组织细胞的正常功能。研究表明，急性运动后Nrf2基因敲除小鼠的抗氧化蛋白酶含量明显低于正常组〔17〕；一次大强度力竭运动可提高小鼠Nrf2基因转录〔14〕。

本实验表明机体脂质过氧化产物增多，且抗氧化能力明显不足；氧化应激状态下Keap1与Nrf2解离，Nrf2核转位参与抗氧化功能。长时间力竭运动后机体疲劳未恢复，抗氧化能力下降，导致Nrf2表达量下降，Nrf2不能更好地启动下游抗氧化酶GSH-Px、SOD的生成，机体抗氧化能力不足，无法有效清除氧化代谢产物，疲劳状态持续存在。本文结果提示小建中汤可以通过提高Nrf2表达，增强下游抗氧化蛋白酶GSH-Px、SOD的活性，逆转力竭大鼠氧化应激损伤。由此可见，小建中汤通过调节Keap1-Nrf2-ARE信号传导通路提高GSH-Px、SOD抗氧水平而发挥抗疲劳的作用。