间充质干细胞治疗肾纤维化作用的研究进展

喻希综述 刘修恒审校

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是1966年Friedenstein等首次发现的。来自人体的各种组织，如骨髓、脂肪组织和胎盘等[1]。它们这些强大的分化潜力，为临床治疗各种疾病提供了新的方法[2]。另外，MSC的来源广泛，获取、培养、扩增、纯化也相对容易，免疫原性低，并且较少有伦理冲突[3]，所以MSC在组织工程、基因治疗和免疫治疗中具有很大的潜在应用价值。

肾纤维化是慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)进展至终末期肾脏疾病(end stage renal disease，ESRD)的主要过程，伴随着高发病率和病死率[4-5]。以肾小球硬化和肾小管间质纤维化为特征，肾纤维化是一个动态过程，由4个阶段组成：启动、激活、执行和进展[6]。目前没有有效的药物来阻止ESRD的发展。因此，非常需要预防或逆转肾纤维化的新策略。基于此，现综述不同来源的MSC以及MSC产生的不同物质对肾纤维化的作用，并初步评估其疗效和安全性，旨在提供对肾纤维化治疗新的见解。

1 不同来源MSC对肾纤维化的作用

1.1 骨髓来源间充质干细胞(bone marrow derived MSCs，BM-MSCs) 目前已有很多动物研究已经证实了BM-MSCs可以改善肾纤维化模型动物的肾功能。

Lira等[7]研究发现MSC治疗肾血管性高血压可以降低收缩压、肾素、血管紧张素和1型血管紧张素受体，上调2型血管紧张素受体和膜蛋白的表达，恢复肾脏Na-K-ATP酶活性。此外，MSC还可以改善肾形态，减少肾脏纤维化和转化生长因子-β(TGF-β)表达，减少蛋白尿。Xing等[8]报道，将BM-MSCs经小鼠尾静脉注入小鼠单侧输尿管梗阻模型(unilateral ureteral obstruction，UUO)小鼠体内，与对照组相比，BM-MSCs组的肾间质纤维化显著减弱，并且抑制了UUO诱导的肌成纤维细胞的活化和增殖，减少UUO小鼠中巨噬细胞的肾小管间质浸润，起到了保护肾功能的作用。Matsui等[9]进行了一项研究，在UUO模型中，BM-MSCs通过降低STAT3的活化和STAT3依赖的MMP-9的产生，在一定程度上防止了梗阻引起的肾纤维化，也能促进肾功能恢复。Lang等[10]在糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)大鼠的疾病模型中研究证实，BM-MSCs能显著抑制DN大鼠肾纤维化，机制可能与抑制TGF-β1 / Smad3通路、减少PAI-1蛋白质的表达、减少细胞外基质的积累相关，从而平衡了纤溶系统，保护肾功能。Gregorini等[11]体内外实验证实BM-MSCs通过抑制人抗原R(human antigen R，HuR)抑制了肾素血管紧张素系统来预防纤维化，研究结果提示BM-MSCs可能通过某种分子机制在具有共同的RAS激活途径的疾病中起预防纤维化作用。 Yoshida等[12]进行了一项研究，发现用无血清培养基培养的BM-MSCs通过改变巨噬细胞的极性抑制炎性反应，通过肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(tumor necrosis factor-α-induced protein 6，TNFαIP)抑制炎性细胞聚集，较用含10%胎牛血清培养基培养的MSC更有利于减弱UUO小鼠肾纤维化程度。

综上所述，BM-MSCs可减轻纤维化进程，并可抑制炎性反应、凋亡和EMT相关的调节因子。这些因素主要涉及几个信号通路包括：TGF-β1/Smad、NK-κB、JAK-STAT通路。

1.2 脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSC) 脂肪组织作为一种理想的间充质干细胞来源，因其可获得性、丰富性和自充盈性而受到广泛关注[13]。关于ADSC的研究非常丰富，包括自体、同源性和异种ADSC移植。

Zhu等[14]研究ADSC对肾纤维化的作用中发现， ADSC可上调肾小管Sox9的表达，促进肾小管再生，减轻AKI，并减轻随后的肾纤维化，最终改善肾功能。Burgos-Silva等[15]研究ADSC在急性肾损伤和慢性肾损伤小鼠中的作用，发现ADSC可以通过调节炎性反应和细胞周期，在肾毒性损伤的肾脏中发挥保护作用，促进肾脏损伤恢复和功能改善，抑制器官纤维化，提供长期的免疫调节。Song等[16]使用来自Wistar大鼠附睾周围组织的ADSC，通过将这些ADSC移植到UUO大鼠模型尾静脉，观察到ADSC通过抑制TGF-β1/ Smad2 / 3/7信号传导，降低成纤维细胞特异性蛋白1(FSP-1)、α-SMA、EMT和纤连蛋白的表达，以及减少炎性反应缓解肾脏间质纤维化。Zou等[17]将小鼠ADSCs包被针对肾损伤分子-1(KIM-1)的抗体，涂层抗体ab-KIM-1对ADSC增殖几乎没有影响。在单侧肾动脉狭窄(RAS)模型中，这些经ADSC处理的小鼠表现出毛细血管密度和肾脏灌注的改善和细胞凋亡，氧化损伤和纤维化的减弱(下调PAI-1，但对TGF-β表达没有影响)。对于同种异体ADSC移植研究，在2个试验中进行了研究。Quimby等[18]的研究选择自然发生CKD的猫，每2周接受来自无特异性病原体(SPF)猫脂肪组织的ADSC静脉注射，血清肌酐浓度显著降低。另一个由同一研究小组进行的猫实验表明血清肌酐、磷、钾、GFR、BUN等没有明显的变化[19]。

1.3 人脐带间充质干细胞(umbilical cord MSCs，uc-MSCs) 人脐带间充质干细胞资源极其丰富，采集过程安全、无创[20]。此外，uc-MSCs具有较低的免疫原性，同时较BM-MSCs具有更有效的增殖方式。此外，越来越多的研究证实了这一点[21-22]。uc-MSCs作为一种新兴的干细胞资源具有良好的治疗特性。

Rota等[23]做了一项关于uc-MSCs的研究，指出uc-MSCs具有优于其他间充质干细胞的抗炎抗纤维化作用，能减少巨噬细胞浸润并诱导其向M2型分化，来自uc-MSCs的条件培养基具有相同的细胞保护作用，能诱导肾组织修复，可作为CKD患者最可靠的临床治疗工具。Rodrigues等[24]建立大鼠缺血再灌注损伤模型，然后腹腔注射人uc-MSCs。发现uc-MSCs治疗的大鼠有更好的肾小管功能和促进肾小球滤过，以及较低水平的TGF-β1、巨噬细胞浸润和衰老相关蛋白β-半乳糖苷酶。较少的巨噬细胞浸润可能与较轻的肾纤维化相关。Fan等[25]在腹膜透析(PD)诱导纤维化的大鼠模型中检测了人uc-MSCs的作用。该模型是通过甲基乙二醛(MGO) PD溶液建立的，大鼠腹腔注射uc-MSCs可明显减轻腹膜纤维化(降低了α-SMA和胶原的表达)、炎性反应、血管生成和超滤衰竭。证明了uc-MSCs抑制纤维化可能与TGF-β信号通路相关。

1.4 牙齿干细胞(dental stem cells,DSCs) 类似于MSCs，DSCs也存在于人的一生之中[26]。DSCs有5种类型:脱落乳牙干细胞、牙周韧带干细胞、牙髓干细胞、根尖乳头干细胞和牙滤泡前体细胞[27]。

Barros等[28]探讨了低温保存的DSCs在急性肾功能衰竭(ARF)大鼠模型中的趋向性。经静脉或腹腔注射后，DSCs表现出嗜酸性和周细胞样的特性，并有助于加速肾小管结构的再生，减弱纤维化。此外，Hattori等[29]证实，在缺血再灌注损伤引发的急性肾损伤中，DSCs能够降低炎性因子，促进肾功能恢复。

1.5 羊水来源间充质干细胞(amniotic fluid-derived MSCs,AF-MSCs) 一些妊娠组织，包括羊水、胎盘膜和胎盘，在出生后经常被当作垃圾处理。但是其含有丰富的高多能干细胞资源，包括间充质干细胞。通过在中期进行羊膜穿刺术，可从少量羊水中获得羊水来源的间充质干细胞(AF-MSCs)[30]。目前，几乎所有关于AF-MSCs对肾纤维化的研究均以动物模型研究为中心。

Baulier等[31]采用猪模型，在同种异体肾移植6 d后，通过肾动脉将自体的AF-MSCs直接注射到移植肾。注入AF-MSCs可增强肾小管和肾小球功能，从而消除纤维化，增加体内TGF-β含量，这表明自体AF-MSCs可能通过TGF-β通路发挥抗纤维化作用。Sun等[32]在UUO小鼠模型中表明，人AF-MSCs可以增加微血管密度，从而改善间质纤维化，保护肾功能。Sedrakyan等[33]建立了小鼠Alport综合征模型(Col4a5敲除小鼠)，采用心脏内移植的同源AF-MSCs的治疗方法。结果表明，AF-MSCs在蛋白尿发生前可延迟间质纤维化和肾小球硬化的进展。M2巨噬细胞极化也被证实在AF-MSC治疗的鼠肾脏中起作用。此外，肾素—血管紧张素系统被AF-MSCs抑制可能也有助于缓解肾纤维化。

1.6 外周血干细胞(peripheral blood MSCs，PB-MSCs) 目前对于PB-MSCs的报道比较少。Pan等[34]收集PB-MSCs，经卵母细胞诱导剂纯化，重新编成诱导的间充质干细胞(iMSCs)，随后将iMSCs注射到兔UUO模型中。研究表明，iMSCs显著降低BUN和血清肌酐值，提高肾小球滤过率，降低TGF-β1，并且诱导组几乎没有发生纤维化。

2 MSCs产生的不同物质对肾纤维化的影响

2.1 MSCs条件培养基(condition medium，CM) Liu等[35]研究发现，uc-MSCs-CM可显著降低UUO诱导的丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平，增加谷胱甘肽(GSH)活性。此外，uc-MSCs-CM显著降低UUO肾脏TGF-β1、α-SMA、TNF-α、Collagen-I的表达，促进了肾小管上皮细胞的扩散和抑制其凋亡。此外，E-cadherin表达的增加也反映了肾间质纤维化的有效改善。证明uc-MSCs-CM可保护UUO诱导的肾脏损伤，因此可能是预防CKD进展的潜在工具。

2.2 外囊泡(extracellular vesicles，EV) Grange等[36]研究发现从BM-MSCs分离提取得到的EV显著改善了糖尿病小鼠的一些功能参数，例如白蛋白/肌酸酐排泄，血肌酐和血尿素氮，另外在糖尿病肾病进展期间发生的肾纤维化被显著抑制。Luo等[37]推测MSC通过旁分泌机制释放EV，进而在大鼠模型中显著改善了输尿管纤维化，恢复了输尿管形态发育，MSC-EVs还可以减轻肾积水，减少肾功能障碍和减弱TGF-β1诱导的肾纤维化。Eirin等[38]研究发现，从ADSC分离出来的ADSC-EV可以改善慢性肾损伤，减轻肾纤维化，最终改善肾脏的功能。在肾内递送的ADSC-EV能减少肾脏炎性反应，增加修复巨噬细胞的数量，上调IL-10的表达，提示起了抗炎作用。但他们同时指出，ADSC-EV的长期影响、最佳时间和剂量以及对人类的功效仍需要大量研究。

2.3 MSCs的外泌体(exosome) Ebrahim等[39]发现BM-MSCs的外泌体能引起糖尿病肾的自噬，显著增加肾组织中LC3和Beclin-1的表达，通过mTOR信号通路降低纤维化标志物的表达，从而减弱肾纤维化、改善肾功能并促进肾组织的组织学恢复。Nagaishi等[40]在糖尿病肾病小鼠模型中使用从BM-MSCs纯化的外泌体进行研究，发现外泌体在肾小管上皮细胞中具有抗凋亡作用、抗纤维化和保护细胞紧密连接结构的作用，肾小球系膜底物的增加受到抑制，从而指出BM-MSCs通过旁分泌作用的肾营养因子，包括外泌体发挥治疗作用。 Wang等[41]报道在UUO小鼠模型中，BM-MSCs通过外泌体携带miRNA-let7c选择性地聚集于受损肾脏，上调miR-let7c基因表达，发挥抗纤维化作用。

3 MSCs对肾纤维化的不利影响

尽管大多数研究均显示MSC治疗能够给患者带来益处，但是也有相反的报道。Kim等[42]报道1例经过自身MSC治疗后肾功能迅速恶化患者，在自体骨髓间充质干细胞输注1周后，肾功能在无明显诱因下迅速加重，MSC给药后3个月开始血液透析。肾活检示重度间质纤维化和炎性细胞浸润，少数细胞表达CD34和CD117表面标志物。

综上所述，基于MSC的肾纤维化治疗因其来源广泛、获取和收集方便、免疫原性低、不良反应低等优点而越来越被人们所接受，具有广泛的研究前景。