环境污染物对斑马鱼神经毒性的研究进展

王 佳，吴航利，管融资，安 鹏，雷 忻*

(1.延安大学生命科学学院；2.延安市生态恢复重点实验室，陕西延安716000)

斑马鱼(Daniorerio)是一种小型亚热带淡水硬骨鱼，也被称为蓝条鱼和花条鱼，属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio)。因其主要神经递质系统的功能与哺乳动物具有相似性、具有简单而区分清晰的脑组织、透明度很高的胚胎和绒毛膜、胚胎体外发育迅速等特征，已被大面积用于生态毒理学实验，成为神经生物学中的常见动物模型[1-6]。此外，斑马鱼符合替代、减少、优化原则；胚胎在发育早期透明度高，其神经细胞的变化可以被很清晰的观察到，这也使得斑马鱼在毒理、药物筛选和遗传的研究中的应用越来越广泛[7，8]。本文就几类主要的环境污染物胁迫对斑马鱼的神经毒性研究进行综述并在此基础上对以后的研究加以展望，为斑马鱼在神经毒性研究中的应用提供了参考和思路。

1 农药胁迫对斑马鱼的神经毒性效应

农药因其稳定的化学性质，几乎很难被降解，同时对生物又具有多种毒性，包括：生殖毒性、内分泌干扰毒性、神经系统及免疫系统抑制毒性等，也可以使人类健康以及环境受到严重威胁[9]。根据其效应和结构特点又可分为神经抑制类农药、手性农药。

1.1 神经抑制类农药

有机磷农药、氨基甲酸酯类农药和拟除虫菊酯类农药可影响动物神经系统的传导，从而产生对神经的毒性作用，所以把这几类农药归纳为神经抑制类农药。胆碱能受体由毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChR)和烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)组成。胆碱能受体在整个中枢神经系统中差异表达，在神经元分化、基因表达调控、突触的形成与成熟、神经递质释放这些调控中均起着重要的作用。因此，因这两者活性的变化为指标更能体现出农药对斑马鱼的神经毒性效应。

刘亮通过检测斑马鱼体内mAChR、nAChR的水平来表述有机磷农药马拉硫磷、氨基甲酸酯类农药灭多威和拟除虫菊酯类农药溴氰菊酯对斑马鱼两者活性的影响[10-13]。结果显示：暴露前期，低浓度的农药组基本上都出现了mAChR活性升高的现象，这与生物逐级行为模型中前期的刺激过程有关。随着暴露时间的延长，mAChR的活性表现为显著的降低趋势。在大部分浓度的暴露前期nAChR的活性就会有明显的降低，而活性随暴露时间的增加而降低的现象并不明显，且在暴露过程中，nAChR的活性经常会一直保持在一定的范围内，这也说明农药对nAChR活性的抑制不是很明显。有时mAChR和nAChR活性在暴露期间升高，这被认为与斑马鱼对农药环境的适应性和新陈代谢的调节以及与生物逐级行为模型的调整阶段有关。

相关研究表明：有机磷类农药的神经毒作用机理主要是使神经末梢的乙酰胆碱酯酶磷酸化而失活，导致毒覃碱效应、烟碱效应；氨基甲酸酯类农药进入机体主要作用的神经细胞轴突，引起钠通道持续开放，导致膜电位长久去极化，从而引起神经兴奋性传导障碍；拟除虫菊酯类农药神经毒理的分子机制是多方面的，主要包括：对脑组织生物膜影响、对神经递质的影响、对神经信号传导过程的影响、对神经细胞损伤机理等。

1.2 手性农药

周炳以人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y)为体外研究模型，研究了马拉硫磷对神经细胞以及马拉硫磷对映体对神经细胞毒性的选择性差异，以斑马鱼胚胎为体内研究模型研究马拉硫磷对映体对斑马鱼胚胎发育的影响。在本研究中测定了马拉硫磷R-体和S-体对SH-SY5Y神经细胞生长影响的选择性差异。结果显示，马拉硫磷R型马拉硫磷(R-体，马拉硫磷对映体的一种)对神经细胞生长的抑制效应高于其外消旋体和S型马拉硫磷(S-体，马拉硫磷对映体的一种)。这种手性选择性差异的来源，可能与手性化合物与生物大分子如蛋白质相互作用的差异以及手性化合物生物转化的选择性差异有关。细胞形态学观察发现，R-马拉硫磷对于细胞的生长及其形态改变的影响最为显著。这说明对于人成神经细胞的生长而言马拉硫磷存在着一定的手性选择性细胞毒性。造成这种对映体选择性差异的原因可能是因为一般手性农药作用的靶标和非靶标生物都是手性的，包括水体在内的自然环境也是手性的，外来的手性化合物进入手性环境中，不同对映体在环境中的代谢、毒理也会存在差异。而对于斑马鱼胚胎的研究结果表明：马拉硫磷对斑马鱼胚胎发育的影响也存在显著的对映体选择性，与其对神经细胞的毒性存在着明显的对映体选择性相一致[14-17]。

2 临床药物胁迫对斑马鱼的神经毒性效应

一些药物由于不同程度的神经毒副作用威胁到病人的安全，严重影响了它的使用，即使已经在使用了这些隐患也会使其最终退出市场。因此，早期的神经毒性评估是药物风险评估的重要构成部分。

2.1 氟喹诺酮类

氟喹诺酮类(FQs)主要用以治疗消化道感染和腹腔及软组织等感染。肖超强通过测定具有典型结构的FQs对运动行为的影响方面，探索FQs结构与其神经毒性的关系，发现FQs结构的变化能够改变其毒性特征，在C-7位置的哌嗪环结构的分裂可以降低药物的神经毒性；C-3位的脱羧基和C-5的NH2取代衍生物可能具有更大的神经毒性[18]。贺诗静利用反转录实时定量PCR(qRT-PCR)仪器以及全胚原位杂交技术和显微注射法进行实验得出氟喹诺酮类药物诺氟沙星(Norfloxacin，NOR)干扰了干细胞标志基因、神经元标志基因、神经胶质细胞标志基因的表达，并可能扰乱早期胚胎神经发育中各系细胞的分化平衡，影响胚胎正常的神经发育。实验表明NOR对斑马鱼胚胎的神经毒性是通过破坏神经元、神经胶质细胞系的分化平衡来实现的[19]。此外，NOR的毒性作用可能与神经系统中细胞的凋亡异常有关，异常可能是由于N-甲基-D-天冬氨酸受体的过度激活。

FQs的神经作用发生机制并未完全清楚，可能的机制包括与其他药物的药代相互作用；药效相互作用；FQs自身的药理作用，与神经递质的相互作用被认为是主要原因。FQs自身药理对神经系统的作用机制包括抑制γ-氨基丁酸受体、激活N-甲基-D-天冬氨酸受体等。

2.2 丙泊酚

丙泊酚是一种烷基酸类的短效静脉麻醉剂，用于全身麻醉的诱导和维持。静脉注射后快速稳定地进入麻醉，并从麻醉中恢复所花费的时间少。

郭培培通过实验探讨丙泊酚对斑马鱼的神经毒性作用以及斑马鱼胚胎细胞凋亡与丙泊酚暴露是否有关，结果证实丙泊酚可以影响幼鱼的大脑组织结构、诱导细胞凋亡[20]。此外，丙泊酚暴露对斑马鱼的神经毒性作用持续存在，丙泊酚在暴露后24 h仍能诱导幼鱼脑细胞凋亡。丙泊酚可影响突触的形成过程，通过影响树突棘的形态和浓度，突触结构的数量来改变神经信号的传导，最终导致神经系统发育崎形，出现行为的异常

2.3 抗精神病药

氯丙嗪(Chlorpromazine，Cpz)一种吩噻嗪类药物，是中枢多巴胺受体的拮抗剂，临床上用以治疗精神类疾病、镇吐等。史慧勤等用胚胎接触氯丙嗪的方式，利用吖啶橙染色，发现胚胎中的凋亡细胞主要分布在中脑和后脑及其交接处，石蜡切片的病理检查显示Cpz暴露后斑马鱼幼年大脑发育不良，脑细胞体积减少，脑细胞间隙增大[21]。

氟哌啶醇(Haloperidol，Hal)一种丁酰苯类药物，与Cpz疗效类似，临床上用于急性精神分裂症的缓解和治疗，同时作为吩噻嗪类药物的替代和补充。王镇的实验结果进一步证实：Hal可以改变斑马鱼多巴胺能神经元的数量进而改变其行为[22]。此外，值得注意的是：在Hal环境下5 d后，将斑马鱼转移至治疗和减轻帕金森病(PD)的药物左旋多巴中2 d，Hal对幼鱼的神经毒性引起的僵硬、行动不便且缓慢等症状明显减轻。此类实验表明抗精神病药是通过影响斑马鱼神经系统发育进而影响斑马鱼的行为。

3 金属胁迫对斑马鱼的神经毒性效应

目前，水环境污染的特征是大量污染物，特别是包括神经毒素在内的微污染物混合物。其中重金属具有蓄积性而且其来源广泛，涵盖大部分农用化学药品、工业、冶炼、化工等行业，它不仅直接危害水生生物，还通过食物链威胁高营养级的物种健康。最终，它危害人类并对生态系统造成严重的破坏[23]。大量研究表明金属尤其是重金属中毒是造成神经疾病发生的重要原因之一。本文主要概述了两种金属Al和Pb。

3.1 Al

已有文献报道，铝能渗透血脑屏障进入大脑，在整个脑内积累，特别是海马区；可能导致神经元凋亡和神经炎症，最终造成学习记忆及运动行为的改变，但还未明确Al对神经系统作用的具体机制[24-28]。

崔国祯等通过斑马鱼行为学、ROS水平和转录组学研究，探讨了铝对斑马鱼神经毒性的作用及其毒性的分子相关机制。实验结果表明：AlCl3处理显著改变了介入调节两种神经退行性疾病的基因表达，包括：肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)相关基因表达特异性上调；老年痴呆(AD)相关基因增强子特异下调表达。此外，AlCl3处理后，诱导斑马鱼幼鱼发生了脑部等ROS产生增多，氧化应激水平升高，发生细胞损伤。斑马鱼幼鱼的神经前体细胞中特异表达的转录因子Neurogenin1表达下调30多倍，对神经元的分化很可能有显著的抑制作用。这说明铝可能通过诱导氧化应激和调控Neurogenin1等多个与神经系统相关基因的表达，对行为学产生损害[29]。

谈勇等通过荧光定量PCR检测血脑屏障及神经系统相关蛋白-密封蛋白(claudin)的mRNA表达水平的变化来验证Al对斑马鱼神经系统的影响，发现密封蛋白家族的cldn5amRNA水平在低浓度AlCl3暴露时变化并不明显，但在高浓度长时间作用下明显降低[30]。而密封蛋白家族的表达水平下调，会造成血脑屏障作用减弱，从而使铝离子入脑[31]。

3.2 Pb

Pb具有多种毒性，包括神经毒性、生殖、免疫和肝脏毒性；但是神经系统是Pb中毒后机体表现最明显的系统，也是Pb作用的主要靶标[32]。

陈香平等通过Pb急性暴露实验说明Pb暴露对斑马鱼产生明显的神经行为毒性，具体表现为：增加斑马鱼自主运动频率，降低触摸反应能力、自由泳动活力以及对光暗周期刺激的游泳速率等。斑马鱼运动行为异常与毒物影响其运动神经元生长，阻碍树突和轴突之间的信号传递有关。这也证明了Pb抑制初级神经元的生长[33]。张晴等通过实验进一步证明了Pb暴露会诱导精神运动损伤[34]。目前一些研究表明铅暴露能够诱导斑马鱼仔鱼神经行为变化，可能的机制包括中枢神经系统基因表达的改变、运动神经元的损伤以及氧化损伤的增加等[35-38]。

4 阻燃剂胁迫对斑马鱼的神经毒性效应

阻燃剂是用于改善材料燃烧性能的化学物质制剂。其阻燃效果通过吸热作用、遮盖作用等来实现，并广泛用于处理各种装饰材料。根据阻燃元素可以把阻燃剂分为：磷系阻燃剂、卤系阻燃剂等，本篇抽取了磷系阻燃剂中磷酸酯类阻燃剂磷酸三苯酯和卤系阻燃剂中有机氯化物阻燃剂得克隆两种典型的阻燃剂进行概述。

4.1 磷酸三苯酯

磷酸三苯酯(Triphenyl phos phate，TPP)是一种用于印刷、电子和制造业的有机酯类阻燃剂。有机磷酸酯类阻燃剂因在结构上与有神经毒性的有机磷杀虫剂类似，所以TPP是否具有神经毒性也被大众关注[39]。

彭涛等人研究表明：暴露于高浓度的TPP导致神经系统相关基因gap43和α1-tublin转录水平降低，这两个基因转录水平变化提示神经元的发育受到干扰，所以这也能说明TPP可以改变参与神经发育的基因的转录[40]。同时，TPP暴露也可以影响斑马鱼幼鱼的游泳行为，而这种行为的变化则很可能是由于神经发育相关基因转录水平以及乙酰胆碱酯酶的变化所导致的。

4.2 得克隆

得克隆(Dechlorane plus，DP)是一种脂肪族氯系阻燃剂，广泛用于塑料、用于传输电的电缆电线和电脑里连接器等产品[41]。

陈香平等通过探讨DP的急性暴露对斑马鱼胚胎的神经毒性作用得出了DP会抑制初级神经元轴突的生长，加快尾部细胞凋亡[33]。此外，DP可以干扰斑马鱼的甲状腺激素水平，影响和改变泥鳅乙酰胆碱酯酶活性。甲状腺激素和乙酰胆碱酯酶都与神经系统发育和神经递质传递密切相关，这提示DP对斑马鱼具有潜在的神经毒性作用，但其作用机制目前并不清楚[42-44]。，

5 展望

斑马鱼在生态毒理学研究中具有非常高的应用价值，是水生生态毒理学新兴领域具有前景的受试生物之一。目前，学者们对于斑马鱼开展了上述神经毒性研究，取得了显著成效，但目前仍存在一些问题：(1)受体活性恢复现象发生在神经抑制类农药的影响研究中，这可能与农药的毒性机制和斑马鱼对农药环境的适应有关。胆碱能系统是一个复杂的系统，各组分相互协调相互作用，就单从两种受体的实验并不能排除胆碱能系统中的其他因素的作用。此外，关于手性农药的研究中，虽然证实了其对斑马鱼神经毒性的选择对应性，但并不能很好的解释为何会有这种差异的出现，这种手性选择性差异是否与细胞膜上的离子通道的作用以及化合物与细胞大分子的作用有关，目前还不能确定。未来开展农药污染物对斑马鱼的神经毒理效应的研究可以从离子通道和农药化合物在斑马鱼体内的转运机制以及胆碱能系统的整体性来进行。(2)临床药物对斑马鱼神经毒性的影响主要表现在细胞凋亡、神经元的数量变化等方面。值得关注的是有些药物对斑马鱼的毒性影响经过拯救实验是会有缓解的，如何抑制其有害特性同时维持药物原有的功能是治疗药物毒理学研究的一个重要方向。(3)金属污染物主要是透过血脑屏障对机体起毒害作用，但其具体的透过方式及机制在国内并未有比较明确的研究；此外，重金属混合暴露毒性具有协同效应，因此即使少量的暴露仍具有强烈的毒性作用，至于其混合造成的影响是否改变了其单一暴露的毒性尚未明确，这也是未来开展重金属污染物对斑马鱼的神经毒理效应研究提供了方向。目前相关的研究均停留在基因水平上，缺少蛋白水平的验证，后期可以对确切的蛋白作用机制进行进一步的深入研究。(4)对于TPP是否因具有和有机磷杀虫剂相似的结构而具有神经毒性，目前还存在争议；已确认DP可干扰斑马鱼甲状腺激素水平，开展阻燃剂类污染物对斑马鱼的神经毒理效应可以从内分泌干扰作用方面进行。

综上所述，未来环境污染物对斑马鱼神经毒性的研究可以在以下三个方面做进一步探索：(1)加强神经毒性效应相关的基因分析，更多地在蛋白质组学和基因组学了解斑马鱼机体功能的应激机制。(2)污染物对蛋白质及酶等生物大分子的毒性作用机理。(3)信号通路和离子通道调控作用。