循环肿瘤细胞检测对评估头颈部肿瘤疗效及预后的研究进展

由 伟 王若雨，2*

1．遵义医科大学(贵州 遵义 563099)；2.大连大学附属中山医院(辽宁 大连 116000)

头颈部肿瘤是全球癌症死亡率排名第六位的恶性肿瘤，全世界每年约65万新发病例，大约导致35万例患者死亡[1,2]。过去几十年里，随着影像学及治疗手段不断进步，目前形成了以手术、放疗和化疗联合的综合治疗模式，该模式使肿瘤局部控制率显著提高，但总生存率未见明显提高，五年存活率仍约40%～50%[3-5]。由于患者早期症状不明显及缺乏早期诊断及检测手段，约三分之二的患者发现时已处于晚期，早期发现的患者即使经过积极的一线治疗仍有约20%～30%发生局部复发或/和远处转移，远处转移是88%的患者死亡的主要原因[6]。因此如何能够及时发现复发和转移从而指导临床个体化治疗，最终使患者获益尤为重要。头颈部肿瘤由于其解剖结构的特殊性，各种形式的内窥镜检查和肿瘤组织活检是诊断的金标准。这种侵入性检查的缺点包括患者无法耐受多次组织活检且价格昂贵；在难以取材的区域则可能无法明确诊断；样本单一用于诊断疾病无法考虑肿瘤的异质性等[7]。因此急需方便且准确的检查方法能够在转移灶出现之前识别具有转移高风险的患者，从而提高个体化治疗的能力。仅需抽取外周血即可获得标本的液体活检提供了一种可以以较少侵入性和简单的方式跟踪疾病状态的方式，从而来确定疾病复发及进展。

液体活检是指基于外周血中遗传物质的肿瘤遗传特征的分析，已用于监测实体肿瘤的治疗效果以及追踪耐药机制[8]。这种非侵入性方法与传统的组织活检相比具有以下几个优势：获取标本容易；允许多次取样；微创；快捷；可能提供更全面的异质性疾病的复杂分子谱等[9]；血行转移是肿瘤重要转移方式之一，早在1869年病理学家Thomas Ashworth首次提出了转移性肿瘤患者血液中存在循环肿瘤细胞(CTCs)[10]。循环肿瘤细胞是指外周血中来自肿瘤原发灶或转移灶中的肿瘤细胞，在各种细胞因子的作用下进入血液及淋巴管循环，进入循环的肿瘤细胞仅有小部分会克服细胞凋亡、免疫系统消除、流体湍流而存活形成为转移灶。作为一种非侵入性液体活检的方法，已在转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌中广泛应用[11-13]，然而CTCs在头颈部肿瘤中的价值目前尚不清楚，这方面研究相对较少且结论不一致。本文就在头颈部肿瘤领域应用CTCs检测这种工具的具体方法原理、可行性、临床价值以及问题展望等方面做一个较为全面的综述。

1 CTCs概述

CTCs分析过程包括分离、富集、检测、计数和分子生物学分析。由于CTCs在外周血中十分罕见，十亿个血细胞中可能只有一个CTCs且半衰期短，因此如何高效分离、富集CTCs对于整个CTCs的检测过程举足轻重。常用的分离、富集技术是利用CTCs不同特性将它们与血细胞分离，包括基于物理特性(大小、密度、电荷)、生物学特性(免疫磁性分离以及新兴的微流控芯片技术)两种方式。生物学特性分离富集主要有两种选择方式：阳性选择和阴性选择。阳性选择是指利用特异性抗体与上皮细胞表面EpCAM抗原结合来捕获CTCs；阴性选择是指因白细胞表面存在标志蛋白CD45，但其不在CTCs表面表达，所以利用白细胞抗原CD45去除白细胞从而来分选CTCs。最后将样本进行荧光扫描，系统会结合荧光染料试剂识别CTCs，将检出CD45阴性、肿瘤特异性细胞核抗原DAPI阳性、角蛋白CK8、18、19阳性的细胞,判定为CTCs从而进一步行分子生物学分析。目前常用的分子表征检测方法有免疫荧光法(IF)、免疫荧光杂交(FISH)、RT-PCR、二代测序(NGS)等[14,15]。CTCs的上皮间质转化(EMT)过程是指CTCs通过下调上皮标志物和获得间充质特性从而来增加迁徙及侵袭能力，导致细胞表型的显著变化，由于EpCAM抗原并不在表达EMT的细胞中表达，而检测CTCs的大多数系统都是基于上皮标志物EpCAM抗原的表达，因此在最近的一篇报道中认为CTCs的阴性选择可能优于阳性选择，因为它并不受细胞初始表面标记物的限制[16]。由于EMT的机制越来越被接受且在许多实体瘤的转移中发挥作用，因此在寻找CTCs的有用检测标记物时很少有研究开发出一种系统来富集和检测没有这些上皮标志物的CTCs，相反来使用表面标志物包括细胞质波形蛋白，N-钙黏着蛋白，O-钙粘蛋白，EGFR或肿瘤干细胞标记物CD44来检测CTCs[17]。目前用于检测CTCs的方法多种多样，包括Oncoquick、ISET、MACS、Cell Search系统、CellCollector(r)、IFISH-CTC、RT-PCR、AdnaTest、CTC-chip等。虽然检测CTCs的系统种类繁多，但很难将上述检测技术进行比较，首先研究队列本身差异很大，另外CTCs在循环中的半衰期一般不到24小时，因此血液收集和储存的时间的不同也是比较不同技术时应该考虑的因素。迄今为止，CellSearch系统是唯一一个被美国食品和药物管理总局(FDA)批准的自动化及标准化的CTCs检测系统。该系统具有早期筛查、快速疗效评估、辅助患者分期分级、监测耐药情况、预测肿瘤转移复发风险的作用，目前已被批准用于转移性乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌的疗效监测及预后评估[18-20]，但在头颈部肿瘤领域目前尚未获得批准。

2 CTCs在头颈部肿瘤的应用

2.1CTCs在头颈部肿瘤的检测可行性

Cell Search系统可以在多种肿瘤中检测出CTCs，包括乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤、胃癌等。Bozec等人发现在晚期头颈部肿瘤患者中有3/9(33%)和8/49(16%)例分别检测到了CTCs[2]。Nichols等发现在6/15(40%)例头颈部肿瘤患者检测到了CTCs[21]。以上结果表明在头颈部肿瘤中可检测出CTCs。

2.2CTCs在头颈部肿瘤中的临床价值

目前已有多篇研究表明CTCs与临床特征的相关性，既往研究表明CTCs水平与年龄、性别、病理类型、部位、肿瘤分期、肿瘤负荷、T/N分期等病理特征参数无关，然而近年来结论不一。在Buglione等人的研究中表明IV期以及肿瘤高负荷的患者外周血中更易检出CTCs(16%对比6%)[22]。该结论同样在Guney等人的研究中得到证实，Guney等人在21例刚确诊未经诊治的头颈部肿瘤患者中检出7例CTCs，同样发现分期越晚越易检出CTCs[23]。在He等人的研究中表明N2-3期患者更容易发现CTCs[24]，这与Hristozova等人的研究结果相似，其表明N2b期的患者更易发现CTCs，与T分期及肿瘤负荷无关[25]。而在Buglione等人观察到在某些部位更易发现CTCs，口咽、下咽和鼻窦部的发现概率为5/39(13%),2/5(40%),3/6(50%)，然而在口腔癌(0/3)及鼻咽癌(0/10)患者中未发现CTCs，表明口咽部、下咽部及鼻窦部区域具有更高的表达上皮标记物的能力[22]。虽然在头颈部肿瘤中关于检测CTCs方面的研究不多，但上述研究结论与之前的研究结果明显出现不一致。不仅在血行转移中，在淋巴结转移中同样出现CTCs的身影，Hristozova等人表明CTCs与区域性淋巴结转移具有相关性[25]。上述结果虽因纳入患者样本量例数及入组条件不一致，这可能导致相关结论不一致，但随着检测手段不断提高，其结论均表明头颈部肿瘤中CTCs与临床病理特征之间可能具有相关性。

CTCs检测在头颈部肿瘤中评估疗效及预后方面的作用还在研究过程中，目前有限的研究表明CTCs在评估头颈部肿瘤预后方面可能具有一定作用。在Jatana等人研究发现CTCs与无病生存期(DFS)相关，检测出较高数量CTCs的患者预后不良[3]。同样在Guney等人的研究中表明检测到CTCs患者更易复发转移[23]。Wang等人在一篇包含433名患者的8项研究进行荟萃分析表明，CTCs阳性组其肿瘤更易进展[26]。Tinhofer等人研究表明口咽癌患者中CTCs与无病生存期(DFS)及总生存期(OS)相关，表明在口咽癌患者中CTCs存在标志着预后不良[27]。并且除基线CTCs可以提供预后信息以外，治疗过程中CTCs数量的变化还可以提供额外信息，若治疗中的CTCs持续存在则可以早期识别对治疗无反应的肿瘤，从而及时更换治疗方案。CTCs数量与治疗反应之间的相关性在头颈部肿瘤中相关研究较少，因此有必要进行大样本的前瞻性临床研究从而进一步探索CTCs检测在头颈部肿瘤中监测疗效及评估预后的临床价值。

3 问题及展望

CTCs检测在头颈部肿瘤早期诊断、疗效监测及判断预后的价值的研究一直进行的如火如荼，但多项研究均并未取得一致结果，从而并未在临床上大范围应用。原因可能有以下几个方面：(1)头颈部肿瘤由于解剖起源位点的不同生物学和临床特征，因此导致既往各研究对象均是小患者队列、不同的患者群体，导致研究结果可能不一致；(2)纳入研究课题样本量较少影响研究结果；(3)由于头颈部肿瘤患者的异质性，头颈部肿瘤包含5种不同的亚型并且其转移潜能根据肿瘤起源的解剖部位而变化，因此导致结果的不一致性；(4)目前并无用于检测CTCs的标准方法。因此对于头颈部肿瘤患者，未来研究需要使用不同临床亚型的大规模患者群体、标准化的CTCs检测方法进行全面研究，从而明确CTCs检测在头颈肿瘤患者中的临床意义，以期为临床筛选潜在的预测疗效和判断预后的标志物提供理论依据，有助于患者的临床管理和个体化治疗，最终使患者获益。