大型真菌担孢子形态观察常用方法简述

陈光富

（丽江师范高等专科学校应用技术学院，云南丽江674199）

大型真菌通常是指子实体较大、结构复杂的一类真菌，俗称为伞菌、蘑菇或蕈菌等[1]，是菌物的重要组成类型。典型的伞菌子实体常由菌柄、菌环、菌褶或菌管、菌托、菌盖、子实层、鳞片等部分组成。子实层是由担子构成的可育层，菌褶或菌管是子实层的着生部位，多数伞菌子实层着生于菌盖下方，担子成熟后释放出担孢子[2]。大型真菌在地球环境保护和化学物质循环中起着重要作用，与森林植被形成共生关系，通过参与物质分解、富集重金属等过程，发挥保护环境的作用。其次，大型真菌也可用于食用、药用和观赏等方面。在我国，真菌资源较为丰富，目前已有17 000 余种被发表报道[3]。在大型真菌分类鉴定中，担孢子的形状、颜色、大小、表面特征、孢子壁厚度等是分类鉴定的主要参考数值，担孢子形态观察是常用方法。目前，观察担孢子特征的方法主要有孢子印肉眼观察、临时装片光学显微观察和电镜标本扫描观察。

1 孢子印肉眼观察

1.1 试剂与器材

刀片或剪刀、不同颜色的薄纸片、培养皿、白乳胶或鸡蛋清提取液、过塑机、硬卡纸、新鲜完好子实体、烧杯、清水。

1.2 制作方法[4-8]

选取不同对比色的薄纸片平铺在实验台面上，将切除菌柄后的子实体（菌盖）菌褶向下平铺于纸片上，罩上培养皿，在室内静置6～48 h，可根据不同伞菌种类或菌盖大小适当设置静置时间。设定时间到后，轻轻移去培养皿和菌盖，可以看到在纸片上遗留有按菌褶呈放射状排列的大量孢子，这就制成了孢子印或孢子堆。为使孢子印上的孢子干后不脱落，可以在纸上涂一层白乳胶或鸡蛋清提取液，等晾干后进行简易保存；如果要长期保存，则在晾干的孢子印后背垫上硬卡纸，过塑保存。

在制作过程中需根据孢子的颜色，选择具有颜色反差的纸，比如孢子是白色则选择黑色纸或半黑半白纸，其他颜色的孢子则选择白色纸。如果要缩短孢子印的制作时间，在接取孢子的薄纸中央剪取适中的开口，将菌柄穿过开口浸入盛有适量清水的烧杯中，将菌盖平铺在薄纸上并在室内避风静置，2～4 h后即可得到清晰的孢子印。

1.3 观察内容

孢子印的制作原理是根据伞菌类担孢子成熟时，在孢子和小梗连接处会分泌出布勒氏液滴，液滴在短时间内会膨大，在孢子弹射时由孢子携带离开小梗的原理制成的。担孢子的数目很大，单一的孢子在显微镜下呈现出无色或有色，当大量孢子堆积在一起时能够呈现出该菌类独具的颜色，而呈现的这种颜色则是菌类分科分述检索鉴定的重要特征之一。因此，制作的孢子印可直接用肉眼观察颜色，根据孢子印的颜色常把伞菌分为粉红孢子类、黄—褐孢子类、紫褐—黑色孢子类和白色孢子类等[3]。其次，可以用手指轻轻触碰孢子粉末，能够直观感受到因孢子壁结构不同而产生光滑或晦涩的触摸感[7]。

2 光学显微镜观察

2.1 试剂与器材

显微镜、电脑（拍摄软件）、载玻片、盖玻片、中性红染液、显微镜、浮载剂（5%～10%KOH）、刚果红染液、单面刀片、镊子、吸水纸、解剖针、蒸馏水、接种环等。

2.2 制作方法

孢子装片观察。先取载玻片置于实验台上，在载玻片中央位置滴1 滴中性红，然后在孢子印上用接种环或解剖针沾取部分孢子粉或用接种环在菌盖的菌褶两侧、子实层表面涂取孢子粉，将涂取的孢子粉轻置于试剂上，染色5～10 min，用镊子将盖玻片盖上，镜检观察，可以观察到单个孢子形态。如果在孢子印或菌褶、子实层上涂取的孢子不理想，可以将子实体的菌柄切除，将菌盖平铺在培养皿内，24 h 后从培养皿中涂取孢子粉观察[9]。

组织块装片观察。取一片载玻片置于实验台上，在载玻片中央位置滴上1～2 滴5%～10% KOH 浮载剂。取新鲜子实体，用徒手切片的方法，用刀片沿菌盖径向切取较薄的组织块，将组织块置于浮载剂中浸泡1～5 min，并立即观察成色反应。如果切取的是干标本或者是不同菌类标本可以适当延长复水时间，让组织充分展开。浸泡过后用镊子将盖玻片盖上，并在盖玻片的一侧滴上刚果红试剂，在另一侧用吸水纸吸引，使组织块着色。或者在加盖盖玻片前在组织块一侧滴入刚果红试剂，并且用解剖针和吸水纸吸引将组织块染色体均匀后在加盖盖玻片。将制成的装片在显微镜下镜检观察[10]。

2.3 观察内容

在光学显微镜下仔细观察担孢子的形状、大小、颜色、孢子壁厚度、囊状体的有无或形状、内含物及成色反应等，或者测量担孢子大小的正面观和侧面观[10-11]，在观察过程中需拍照记录。

在记录和测量过程中，一般测量孢子的长度和宽度。为使测量数据更精确，如果是在新鲜子实体上取的孢子印或组织块，根据菌肉的薄厚随机选取10～25 个成熟孢子进行观察测量，如果在干标本上取的组织块，根据孢子大小差异随机选取20～50 个孢子进行测量；测量侧面观时，一般包括饰纹，附胞不计算。孢子大小范围确定后，就可以计算出Q 值（孢子长宽比），根据Q 值说明孢子形状[3，11]，目前常用的测量标准及划分形态有7 种：①球形，Q=1.01～1.05；②近球形，Q=1.05～1.15，③宽椭圆形，Q=1.15～1.30；④椭圆形，Q=1.30～1.60；⑤长方形，Q=1.60～2.0；⑥圆柱形，Q=2.0～3.0；⑦杆状，Q＞3.0。

3 扫描电镜观察

3.1 试剂与器材

扫描电镜、单面刀片、样品台、硅片（铜片）、喷镀机（溅射仪等）、无水乙醇。

3.2 制作方法

目前，电镜标本制作常用方法是用刀片切取子实体菌盖下菌褶或菌管的一片组织，将切取的组织放置于硅片上（铜片或者组织粘台），用无水乙醇浸润5～10 s 后取出自然干燥，约0.5～1 h 后，将样品固定在样品台上进行真空镀金[11]；或者不用浸润直接将样品固定在组织粘台直接用离子溅射仪喷金，制成电镜标本[12]。也有学者报道直接将滤取的孢子置于铜片或者胶面上，进行喷镀后制成电镜标本[13-15]。将电镜标本制作好后，放在电镜扫描仪下进行扫描观察，并记录。

3.3 观察内容

电镜技术的发展为孢子壁结构、孢子饰纹类型等特征的观察提供了便利，为更好观察孢子壁结构、孢子饰纹形态，在观察过程中应尽量选择成熟饱满的担孢子进行观察记录。在观察测量过程中，一般包括长度、宽度、顶瘤、侧瘤的大小等，并观察孢子表面纹饰类型。孢子纹饰是孢子壁组织向外凸起生长产生的结构[3，11]。孢子纹饰有多个专业术语描述，有学者按凹型与凸型两大类划分为12 种形态描述：①穴纹：指孢子壁具圆形或近圆形的穴状凹陷，口径较大；②网纹：指孢子壁有角形凹陷；③齿状网纹，指网纹网脊上有齿状突起；④沟纹，指孢子壁上长条脊与深陷的长沟槽相间，不成网，条脊彼此多少平行或成角排列；⑤蠕虫纹，指孢壁具短小而弯曲的条状凸起，似蠕虫；⑥颗粒状纹，指圆颗粒状突起，较细小，大小不等；⑦疣状纹，指孢子壁具近半球状突起，宽度大于高度，较颗粒纹大且较整齐；⑧瘤状纹，指末端为钝圆的瘤状突起，高度大于或等于宽度；⑨棒状纹，指孢子壁具棒状突起，顶端圆头鼓糙状，高大于宽；⑩刺状纹，指孢子壁末端一般为较尖的突起，基部较末端宽；11○块状纹，指孢子壁具不规则的块状突起，也可以是云块状；12○瓣状纹，指孢子壁具翅棱状突起[15]。

4 展望

在大型真菌种类鉴定中，随着数值分类、化学分类、基因组学及分子生物学等技术的兴起与推广，菌物分类手段与技术越来越多元化。而利用传统观察孢子印和用显微镜技术对担孢子形态特征进行观察与测量的形态分类手段至今仍然被沿用[1，16，17]，因为这种方法直观可靠，可比性较强，工作开展便利。特别是电子显微镜扫描鉴定技术可以清晰的观测到担孢子壁的表面特征、细胞内含物、孢子纹饰等，能更加精准有效的辅助分类鉴定。因此，担孢子形态观察方法将同菌物的外部形态鉴定、数值分类、化学分类和分子数据与序列对比等技术手段一样成为菌类鉴定和多样性遗传研究的重要手段。