阜阳市2015年恙虫病实验诊断及IgG持续时间探索

刘晓宁，陈 振，刘伯玉，任翠平，柳 燕

恙虫病亦称丛林斑疹伤寒，是恙螨叮咬人体感染恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi, O.ts)而引起的人畜共患传染病[1]。全球50%以上人口生活在恙虫病疫区，每年约有100万人感染恙虫病[2]。在我国，1985年以前恙虫病主要在长江以南(北纬31°)地区流行[3]；1986年后在长江以北出现恙虫病，证实了恙虫病疫源地北移[4-5]。2008年秋阜阳市暴发的不明原因发热疫情，证实为恙虫病疫情[6-7]；Cao et al[8]于2016年报道了安徽省滁州市散发恙虫病病例。恙虫病极易与其他发热性疾病相混淆，出现误诊误治情况[9]。因此，收集阜阳市2015年9～11月的不明原因发热病例标本进行病原学和血清学检测及实验方法相互验证，对病历资料归纳分析，以期为安徽省乃至全国恙虫病的实验室和临床诊断及精准用药和有效防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料、血清标本采集收集2015年9～11月阜阳市不明原因发热疫情临床病例资料，采集发病后6～17 d急性期血液标本235份，发病后4个月采集恢复期血液标本47份。

1.2 主要试剂和仪器DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)；pMDTM18-T载体克隆试剂盒(日本TaKaRa公司)；羊抗人IgM、羊抗人IgG(北京中衫金桥生物技术有限公司)；Gilliam、Karp和Kato混合标准株抗原片(美国University of Texas Medical Branch惠赠)；PCR仪(德国Jena公司)；荧光显微镜(日本OLYMPUS TMT3-21型)。

1.3 间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,IFA)恙虫病IgM抗体定性检测，血清1 ∶80稀释；恙虫病IgG抗体定量检测，血清按1 ∶80、1 ∶160、1 ∶320、1 ∶1 280、1 ∶5 120、1 ∶10 240、1 ∶20 480进行梯度稀释。血清为一抗与抗原片进行反应， 37 ℃、45 min，用PBS洗涤4次，每次5 min，晾干。二抗为FITC标记羊抗人IgM和IgG，重复上述步骤，晾干后滴加90%甘油覆盖抗原片，荧光显微镜下观察。

1.4 巢式PCR(nested polymerase chain reaction, nested-PCR)和产物克隆测序急性期血标本核酸经nested-PCR扩增O.ts 56-ku蛋白特异性基因片断。外引物为 56 ku-out-f: 5′-TACATTAGCTGCGGGTATGACA- 3′和56 ku-out-r: 5′-CCAGCATAATTCTTCAACCAAG- 3′；内引物为56 ku-in-f：5′-GAGCAGAGCTAGGTGTTATGTA- 3′和56ku-in-r：5′-TAGGCATTATAGTAGGCTGAGG- 3′[6]。反应条件为95 ℃、 5 min，1个循环；94 ℃、45 s，55 ℃、45 s，72 ℃、1 min，35个循环；72 ℃、10 min，1个循环。1.2%琼脂糖凝胶电泳PCR产物。将PCR产物连接到T载体中以构建DNA重组质粒。氨苄抗性LB平板培养基培养，蓝白筛选重组质粒，细菌摇瓶培养后送GENERAL BIOSYSTEMS公司测序。

1.5 统计学处理采用描述性流行病学方法进行分析。Epidata 3.1建立数据库，运用Excel 2010和SPSS 20.0软件进行统计和分析。率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验室检查

2.1.1nested-PCR和IFA检测结果比较 nested-PCR检测和测序分析235例急性期血液标本核酸阳性率为63.40%(149/235)，IFA检测235例急性期血清IgM抗体阳性率为86.38%(203/235)；nested-PCR检测核酸和IgM抗体检测阳性率之间进行配对χ2检验，结果显示两种方法之间差异有统计学意义(χ2=6.17,P<0.05)，IgM抗体检测阳性率高于核酸检测(表1)。当急性期血清IgG抗体效价≥1 ∶1 280时，抗体检测和核酸检测结果呈负相关，OR=0.22。nested-PCR检测核酸和IFA检测IgG抗体阳性率差异有统计学意义(χ2=4.73,P<0.05)，即当急性期血清IgG抗体效价<1 ∶1 280时，可同时检测到病原和抗体；当急性期血清IgG抗体效价≥1 ∶1 280时，nested-PCR检测核酸的阳性率下降，双份血清抗体检测敏感性高于核酸检测(表2)。

表1 235例急性期血液标本nested-PCR和

表2 47例急性期血清的nested-PCR和IgG结果比较(例)

2.1.2双份血清IgG抗体检测 免疫荧光检测47例急性期和恢复期血清恙虫病IgG抗体，IgG抗体在发病后的第6天即被检测到，效价达到1 ∶80；随着时间的推移，抗体效价逐渐增加，其变化趋势如(图1)。76.60%(36例)的急性期IgG抗体的效价集中在1 ∶320～1 ∶5 120。恢复期血清抗体效价降低的35(74.46%)例，其中效价有4倍降低的17例，16倍降低的10例，64倍降低的2例；抗体效价有4倍及以上升高的6例，效价无变化的有6例，各占12.77%(表3)。78.57%(33例)恢复期效价集中在1 ∶80～1 ∶320。

2.2 一般结果人群对恙虫病易感，40～49岁人群的发病率最高；女性有208例，占88.51%；男性有27例，占11.49%；农民占所有患者人数的96.60%(227/235)。发病时间集中在10月11日～11月10日，呈现出暴发流行态势。恙虫病最长潜伏期为11 d，最短为4 d，平均潜伏期为(6.85±2.38)d。

图1 IgG抗体出现时间和效价变化趋势表3 IFA检测恙虫病患者双份血清IgG抗体效价结果(例)

效价急性期IgG恢复期IgG4倍升高效价无变化4倍下降抗体消失恢复期IgG1 ∶8063101131 ∶320132271201 ∶1 280150212161 ∶5 1209018031 ∶20 480400310总计476630542

2.3 临床体征

2.3.1发热 所有病例均有发热，平均持续(7.00±4.89)d，平均体温(38.99±0.52) ℃。包括稽留热3例，弛张热8例，不规则热224例。

2.3.2焦痂或溃疡 235例病例中有156例(66.38%)有焦痂和溃疡。分布在：腹股沟(21例)、腋窝(24例)、胸部或乳房(29例)、腰带压迫部位(31例)、腘窝(7例)、上肢(8例)、脚踝(13例)、腿部(6例)、背部(8例)、肛周(4例)、会阴部(5例)。

2.3.3其他症状和体征 除了发热、焦痂或溃疡外，头痛195(82.98%)例，畏寒140(59.57%)例，淋巴结肿大85(36.17%)例，皮疹155(65.96%)例。

2.4 临床检查血常规检查中各项指标多在正常范围内。生化检查中，107例(70.39%)C反应蛋白升高，202例(85.96%)丙氨酸氨基转移酶升高，191例(81.62%)天冬氨酸氨基转移酶升高；总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆红素和碱性磷酸酶多数在正常范围内。136例(63.85%)谷氨酰转肽酶升高；134例(74.03%)乳酸脱氢酶升高；177例(86.76%)α-羟丁酸脱氢酶升高；74例(87.06%)肌酸激酶升高；肌酸激酶同工酶多数在正常范围内。

2.5 治疗和预后临床多给予阿奇霉素(500 mg/d)进行抗感染经验治疗，5 d左右恢复正常，患者预后较好，治愈率达到100%。

3 讨论

恙虫病是存在于自然界中的人畜共患传染性疾病，中国是其主要流行地区[10]。阜阳市自2008年秋季发生了一起恙虫病疫情后[11]，每年10～12月呈现季节性发病。对235例2015年9～11月阜阳市不明原因发热患者血液标本进行分子生物学、生物信息学、血清学实验的相互验证分析，并统计归纳出阜阳恙虫病的临床特征，以便指导长江以北地区恙虫病的实验室诊断、治疗和预防工作。

nested-PCR检测证明，阜阳市2015年秋季的不明原因发热疫情是以恙虫病为主的急性传染病，核酸阳性率为63.4%，IgM抗体阳性率为86.38%，证明了免疫荧光实验中使用Gilliam、Karp和Kato混合抗原能够提高恙虫病感染的早期检出率。核酸检测感染早期阳性率低于IgM抗体阳性率，可能是由于样本抗体滴度较高，导致病原体含量减少，且释放到胞外的病原体少不能被检测到。急性期IgG抗体效价≥1 ∶1 280时，nested-PCR检测的阳性率随恙虫病抗体效价升高而下降。由此判断，当急性期患者血液恙虫病核酸检测为阴性时，如恙虫病血清IgG抗体效价≥1 ∶1 280时，对恙虫病的诊断具有辅助意义。

47份配对双份血清中，恙虫病IgG抗体在患者发病后6 d即可检测到，抗体效价达1 ∶80，在发病后15～17 d达到1 ∶20 480。恙虫病IgG抗体产生较早，且抗体水平增长较迅速。恢复期血样采集于治疗后4个月，有35份(74.46%)血清抗体效价有4倍以上下降甚至消失，说明感染恙虫病东方体后机体产生的IgG抗体维持时间不长，4个月左右有明显下降，甚至消失。据此，可认为恙虫病东方体的IgG抗体对机体的保护力及保护时间有待进一步研究。当然，如果是恢复期连续样本采集和研究，会给出更好的IgG抗体升、降时间曲线。

恙虫病发病存在职业和性别差异，农民是恙虫病的高危人群，且以40～69岁女性为主，这可能与阜阳市是农民工输出大市有关，青壮年劳动力多外出务工，乡下的劳动力以中老年女性为主。暴发流行时间集中在10月11日～11月10日，与江苏、山东等地报道[4]的恙虫病发生时间吻合，为“秋冬季型恙虫病”。

综上，2015年阜阳市的不明原因发热为“秋冬季型恙虫病”疫情。混合抗原IgM抗体检出恙虫病阳性率高，IgG抗体检测可辅助nested-PCR检测提高检出率。人体感染恙虫病后，机体产生IgG抗体时间早，效价升高迅速。在发病治疗后4个月后IgG抗体有较大程度降低甚至消失，说明恙虫病IgG抗体维持时间短，推测可能为恙虫病每年暴发流行的因素之一。