基于响应面法对蜂粮液态发酵条件的优化

张娟，王顺喜，李丹，罗美玲，夏晓华，张坤，段传人，*

（1.重庆大学生物工程学院，重庆400030；2.重庆蜂谷美地生态养蜂有限公司，重庆404508）

蜂粮又叫蜂面包、蜂巢花粉，是蜜蜂将采集的花粉咬碎夯实加上蜂蜜之后，在微生物作用下所形成的自然发酵产物。蜂粮不仅是幼蜂的主要营养来源，更是整个蜂群繁衍生息的重要物质基础。此外，蜂粮还含有丰富的蛋白质、维生素、脂类、黄酮类化合物、生物活性物质等，因此对人体也具有良好的营养保健作用[1-3]。

在对蜂产品的研究中，相对于蜂蜜、蜂胶、蜂王浆，蜂粮的研究较少，但蜂粮作为一类新型的高级营养保健品所具有的营养价值优势逐渐成为共识。杨文超[3]等在单因素试验的基础上采用正交试验对油菜花粉的发酵工艺进行优化，发现发酵后的蜂粮适口性有很大改善，营养价值也得到了提高。朱奇[4]等在研究中发现，利用从天然蜂粮分离出的有益菌株，对蜂花粉进行人工发酵，再加入双歧因子和蜂胶制成的复合制品的抑瘤率可以达到67.6%。可见蜂粮的保健效果逐渐被发现，因此，人工发酵蜂粮具有良好的前景[5-7]。

优良菌株不仅是发酵制品得到良好风味的基础，也是发酵制品质地以及产品稳定性的重要基础，更是保证产品标准化的核心。乳酸菌的作用着重于改善食品的风味，提高产品的保藏性和附加值，此外它还有很多特殊的健康功效，比如改善消化系统功能、抑制肿瘤、降低胆固醇含量、增强抵抗力等[4，7-10]。

响应面分析（response surface methods，RSM）是一种基于数学与统计学的结合，将体系的响应作为一个或多个因素的函数，然后将这种函数关系用图形显示出来，从而使得试验设计中的最优化条件得到确定的方法。本文在单因素试验法的基础上，利用响应面法进行分析，得出人工发酵蜂粮的最优条件，以期为人工蜂粮的工业化生产奠定基础[11-15]。

1 材料和方法

1.1 材料和设备

1.1.1 培养基

MRS 固体培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温80 1 mL，酵母粉4 g/L，琼脂粉15 g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸三铵2 g/L，硫酸镁0.2 g/L 磷酸氢二钾 2 g/L，硫酸锰 0.05 g/L，pH 6.2。

发酵培养基：以松花粉作为液态发酵的主要培养基，为了一定程度地保护花粉的活性成分，90 ℃灭菌30 min，备用。

1.1.2 发酵菌种的选定

通过对天然蜂粮中微生物的分离与鉴定，对分离出的3 株植物乳杆菌进行产酸活性和抑菌活性的测定，确定出产酸能力和抑菌活性最好的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为发酵菌株。

1.1.3 设备

超净工作台（SW-CJ-1BU/18U 型）：苏州安泰空气技术有限公司；生化培养箱（SHP-250 型）：上海精宏实验设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50KBS 型）：上海申安医疗器械厂；摇床（THZ-C 型）：北京寅韬兴业科技有限公司；发酵罐（30L-7000c）：上海保兴生物设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种培养

在超净工作台内挑取1 环～2 环保藏在斜面上的植物乳杆菌，将其接种于MRS 平板上，置于30 ℃的生化培养箱中倒置培养12 h。然后挑取2 环～3 环已活化的菌株到30 mLMRS 液体培养基中，30 ℃条件下摇床培养12 h，制成浓度约为106个/mL 的菌悬液[16]。

1.2.2 乳酸菌活菌数测定

称取5.0 g 发酵好的蜂粮倒入三角瓶（装有适量玻璃珠）中，然后加入15 mL 蒸馏水进行振荡，使样品被研磨成均匀的稀释液。梯度稀释法再次进行稀释，稀释梯度分别为 10-1、10-2、10-3……10-9，在超净工作台内每个梯度吸取100 μL 样品到MRS 固体培养基上，涂布均匀后将平板放入37 ℃培养箱内培养2 d 后选择蜂粮含菌量大概在10 cfu/cm2的梯度平板为适宜浓度，两个平板为一个浓度，结果取平均值[17]。

1.2.3 蜂粮感官评定

1.2.3.1 感官评定评价标准

评价指标主要考虑发酵蜂粮产品的颜色、香气和口感3 个方面，每项指标满分5 分，请5 名专业的食品评判员对这3 个指标进行评分，分别考虑各指标的权重系数后得到最终评分。具体评价标准如表1 所示。

表1 蜂粮感官评分标准Table 1 Sensory evaluation criteria for bee food

1.2.3.2 感官评定指标权重

为了把握单个指标在总评价中的相对水平，请8名从事食品检测和评价的工作人员对以上3 个感官评价因素进行打分，从而确定蜂粮感官评价时各因素的权重。8 名工作人员对蜂粮3 个感官因素的评价结果见表2。

综合表1 和表2，经过计算，蜂粮的颜色、香气、口感的权重系数分别为0.29、0.27、0.44。设蜂粮颜色评分为X，香味评分为Y，口味评分为Z，则蜂粮综合感官评分公式为：蜂粮综合感官评分=0.29X+0.27Y+0.44Z。

表2 感官评定的指标权重Table 2 The index weight of sensory evaluation

1.2.4 液态发酵单因素试验

1.2.4.1 料液比对发酵的影响

称取花粉1 500 g，分别在料液比为0.07、0.09、0.11、0.13 g/mL 和0.15 g/mL 条件下进行发酵，乳酸菌接种量为9%，发酵温度为33 ℃，搅拌转速为400 r/min，当发酵内上的pH 值连续2 d 变化小于0.05 时停止发酵，测量料液比对人工蜂粮乳酸菌活菌数和感官评定指标的影响。

1.2.4.2 乳酸菌接种量对发酵的影响

称取花粉1 500 g，取料液比为0.11 g/mL，分别加入3%、6%、9%、12%、15%的乳酸菌菌悬液，设置发酵温度为33 ℃，搅拌转速为400 r/min 条件下进行发酵，当发酵罐内的pH 值连续2 d 变化小于0.05 时停止发酵，测量乳酸菌接种量对人工蜂粮乳酸菌活菌数和蜂粮感官评定指标的影响。

1.2.4.3 发酵温度对发酵的影响

称取花粉1 500 g，取料液比为0.11 g/mL，设置乳酸菌接种量为9%，搅拌转速设定为400 r/min，发酵温度分别设定为 29、31、33、35、37 ℃进行发酵，当发酵罐内的pH 值连续2 d 变化小于0.05 时停止发酵，测量发酵温度对人工蜂粮乳酸菌活菌数和感官评定指标的影响。

1.2.4.4 搅拌转速对发酵的影响

称取花粉1 500 g，取料液比为0.11 g/mL，设置乳酸菌接种量为9%，设置发酵温度为33 ℃，搅拌转速分别设定为 300、350、400、450、500 r/min 进行发酵，当发酵罐内的pH 值连续2 d 变化小于0.05 时停止发酵，测量搅拌转速对人工蜂粮乳酸菌活菌数和感官评定指标的影响[18-20]。

1.2.5 响应面法优化发酵条件

在单因素试验的基础上，采用中心组合试验Box-Behnken 设计试验因素与水平，见表3。

表3 响应面试验因素及水平Table 3 Factors and levels in the RSM

以乳酸菌活菌数以及感官评定为响应值，利用响应面方法中的Box-Behnken Design 方法设计试验，用Design Expert8.0.6 软件对试验数据进行分析，确定蜂粮人工发酵的最优条件[21]。

2 结果与分析

2.1 料液比对发酵结果的影响

称取1 500 g 花粉，分别在料液比为0.07、0.09、0.11、0.13 g/mL 和0.15 g/mL 条件下进行发酵，乳酸菌接种量均为为9%，发酵温度均为33 ℃，搅拌转速均为400 r/min，在不同料液比的条件下发酵，比较料液比对人工蜂粮蜂粮活菌数和感官评定的影响。乳酸菌活菌数与料液比的关系见图1，料液比对蜂粮感官评定的影响见图2。

图1 料液比对蜂粮活菌数的影响Fig.1 Effect of feed liquid ratio on the number of viable bacteria in bee bread

图2 料液比对蜂粮感官评定的影响Fig.2 The effect of feed liquid ratio on sensory evaluation of bee bread

由图1 可知，随着料液比的增大，蜂粮中乳酸菌活菌数也在增大，料液比为0.13 g/mL，活菌数目达到最大值（1.82×107cfu/g）。观察图 2 可知，当料液比为0.13 g/mL 时，蜂粮的感官评分最高（3.85 分）。因此，确定蜂粮发酵的较适料液比为0.13 g/mL。

2.2 乳酸菌接种量对发酵的影响

选择料液比为0.11 g/mL，发酵温度33 ℃，转速为400 r/min 条件下，测定不同乳酸菌接种量对人工蜂粮乳酸菌活菌数以及感官评定的影响，结果分别见图3和图4。

图3 乳酸菌接种量对蜂粮中乳酸菌活菌数的影响Fig.3 The effect of lactobacillus inoculation amount on the number of live lactobacillus in bee bead

图4 乳酸菌接种量对蜂粮感官评定的影响Fig.4 Effects of lactobacillus inoculation amount on sensory evaluation of bee bread

由图3 可知，随着乳酸菌接种量的增大，乳酸菌的活菌数也呈上升趋势；由图4 可知，乳酸菌接种量小于9%时，蜂粮的感官评分较低，但当乳酸菌接种量超过9 %时，发酵加剧，感官评分也有所降低。综合考虑，选定乳酸菌接种量9 %为蜂粮发酵的乳酸菌较适接种量。

2.3 发酵温度对发酵的影响

选择料液比为0.11 g/mL，乳酸菌接种量为9%，转速为400 r/min，对比不同发酵温度对人工蜂粮乳酸菌活菌数和感官评定的影响，见图5 和图6。

图5 发酵温度对蜂粮中乳酸菌活菌数的影响Fig.5 Fermentation temperature on the effect of lactic acid bacteria number of living bacterium in the bee bread

图6 发酵温度对蜂粮感官评定的影响Fig.6 Fermentation temperature on the sensory evaluation the effect of bee bread

由图5 可知，随着发酵温度的升高，人工蜂粮中乳酸菌的活菌数呈上升趋势，在33 ℃之后趋于平稳；由图6 可知，发酵温度低于33 ℃时，发酵不完全，人工蜂粮感官评分较低，超过33 ℃时温度过高，蜂粮色泽变深，口感也变涩，感官评分降低，综合比较，33 ℃时蜂粮和活菌数和感官评定都较好，因此确定人工蜂粮发酵的较适温度为33 ℃。

2.4 搅拌转速对发酵的影响

选择料液比为0.11 g/mL，乳酸菌接种量为9%，发酵温度为33 ℃，研究不同搅拌转速对人工蜂粮乳酸菌活菌数以及感官评定的影响。结果见图7 和图8。

图7 搅拌转速对乳酸菌活菌数的影响Fig.7 Effect of stirring speed on the number of viable lactic acid bacteria

观察图7 可知，随着搅拌转速的增大，蜂粮中乳酸菌活菌数也呈增大的趋势，根据图8 可知，当转速低于400 r/min 时，人工蜂粮的感官评分较低，而当搅拌转速超过400 r/min 时，人工蜂粮发酵加剧，口感评分降低，综合图7 和图8，确定400 r/min 为人工蜂粮发酵的较适发酵罐搅拌转速。

图8 搅拌转速对蜂粮感官评定的影响Fig.8 Influence of stirring speed on sensory evaluation of bee bread

2.5 响应面法优化发酵条件

在单因素试验的基础上，通过Design Expert8.0.6的Box-Behnken 设计原理，对蜂粮的人工发酵条件进行了四因素三水平试验，所得试验结果如表4 所示。

表4 响应面试验方案及结果Table 4 Experimental scheme and results of response surface

以乳酸菌活菌数以及感官评定为响应值，根据Box-Behnken Design 设计得到的试验结果，利用Design Expert8.0.6 的软件对表4 数据进行分析，得到乳酸菌活菌数（107cfu/g，以 Y1表示）与感官评分（Y2）对自变量装液量（A）、乳酸菌接种量（B）、发酵温度（C）和搅拌转速（D）的多元回归方程：

Y1=1.96+0.1A-0.022B+0.082C+0.27D+0.20AB+0.28AC-0.093AD-0.22BC+0.15BD-0.46A2-0.47B2-0.20C2-0.18D2

Y2=4.38+0.13A-0.012B+1.667×10-3C+0.085D-0.13AB+0.070AC-0.055AD+0.068BC+0.033BD+0.068CD-0.28A2-0.18B2-0.16C2-0.061D2

对回归模型进行可信度分析和方差分析，结果如表 5、表 6 所示。

表5 方差分析结果（以乳酸菌活菌数为响应值）Table 5 Results of variance analysis（taking the number of live bacteria of lactic acid bacteria as the response value）

表6 方差分析结果（以感官评分为响应值）Table 6 Results of variance analysis（response value of sensory score）

续表6 方差分析结果（以感官评分为响应值）Continue table 6 Results of variance analysis（response value of sensory score）

由表5 和表6 可知，两个模型的F 值分别为74.06和220.94，且P 值都小于0.000 1，说明这两个模型的回归方程是极显著的。失拟项都不显著，说明这两个模型的模拟性都较好，模型1 中的复相关系数R2=0.984 7，修正复相关系数R2adj=0.971 4，预测负相关系数R2Pred=0.924 6，表明修正复相关系数0.971 4 与预测复相关系数0.924 6 有着很好的相符度。模型2 中复相关系数R2=0.995 5，修正复相关系数R2adj=0.991 0，预测复相关系数R2Pred=0.975 9，同样，修正复相关系数0.991 0 与预测复相关系数0.975 9 也有着很好的相符度。这说明两个模型都有较好的回归性。模型1 的信噪比为27.825，模型2 的信噪比为52.526，信噪比＞4就说明该模型具有足够的信号来响应设计。因此，这两种模型分别可以对蜂粮中乳酸菌活菌数以及蜂粮的感官评定进行分析和预测[22]。

据表5 和表6 分析，模型1 中B 项无显著影响，其他项均对乳酸菌活菌数有显著影响（P＜0.05），其中A、C 和 D 等一次项，AB、AC、BC、BD 等交互项和 A2、B2、C2、D2等二次项对乳酸菌活菌数的影响极显著（P＜0.01）。模型2 中的C 项无显著影响，其他项均对感官评分有显著影响（P＜0.05），其中 A 和 D 等一次项，AB、AC、AD、BC、CD 等交互项和 A2、B2、C2、D2等二次项对感官评分的影响极显著（P＜0.01）。

F 值的大小反映出因素对试验指标的影响程度，F值越大表示因素对试验指标的影响越显著。由表8 可知，对蜂粮中乳酸菌活菌数的影响大小的因素依次是：因素D＞因素A＞因素C＞因素B（搅拌转速＞料液比＞发酵温度＞乳酸菌接种量）。通过表9 可知，对蜂粮感官评分影响大小的因素顺序是：因素A＞因素D＞因素B＞因素C（料液比＞搅拌转速＞乳酸菌接种量＞发酵温度）。

为了探究两两因素的交互作用对蜂粮发酵的影响，根据表5 和表6 中的试验结果用软件生成三维图，见图9 和图10。

图9 两两因素对乳酸菌活菌数影响的曲面图Fig.9 Surface diagram of the effect of two factors on the number of viable lactobacillus

图10 两两因素对蜂粮感官评定的影响Fig.10 Effects of two factors on sensory evaluation of bee bread

对其进行响应面模拟分析，制作AB、AC、BD、CD之间的响应曲面图，根据曲面形状，分析料液比、乳酸菌接种量、发酵温度、搅拌转速对蜂粮液态发酵中乳酸菌活菌数和蜂粮感官评分的影响，从而找到蜂粮发酵的最佳因素[23-25]。

由图9 可知，料液比和乳酸菌接种量的交互作用对人工蜂粮乳酸菌活菌数的影响较大，而乳酸菌接种量和发酵温度的交互作用对人工蜂粮乳酸菌活菌数的影响较小。

由图10 可知，料液比和乳酸菌接种量、发酵温度的交互作用都对人工蜂粮感官评分的影响非常显著。

利用Design-Expert8.0.6 软件联合求解这两个模型，得出最佳料液比为0.13 g/mL、乳酸菌接种量为9.67%、发酵温度33.17 ℃、搅拌转速445.40 r/min。为验证结果的可靠性，采用上述优化参数再次进行蜂粮液态发酵，为满足实际操作，将料液比调整为0.13 g/mL、乳酸菌接种量调整为10%、发酵温度调整为33 ℃、搅拌转速调整为445 r/min。得到的蜂粮平均乳酸菌活菌数为2.107×107cfu/g，平均感官评分为4.42，和模型预测的乳酸菌活菌数2.060 91×107cfu/g，感官评分4.408 2相差较小，因此确定人工蜂粮液态发酵的最佳参数为料液比为0.13 g/mL，乳酸菌接种量为10%，发酵温度为33 ℃，搅拌转速为445 r/min。

3 结论

以乳酸菌活菌数和感官评分对蜂粮人工发酵参数进行了响应面分析，得到液态小型中试发酵罐（30 L）发酵蜂粮的最佳参数为料液比为0.13 g/mL，乳酸菌接种量为10%，发酵温度为33 ℃，搅拌转速为445 r/min，在此条件下人工蜂粮的平均乳酸菌活菌数为2.107×107cfu/g，平均感官评分为4.42 分。