基于QuEChERS提取的高效液相色谱-串联质谱法同时测定4种不同基质类型化妆品中15种硝基咪唑类禁用药物

陈 岑，黄柳倩，程巧鸳，周明昊，颜琳琦

(浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州 310052)

硝基咪唑类药物(NMZs)是一类具有抗原虫感染和抗厌氧菌的硝基杂环类抗菌药物，在临床各个领域应用广泛[1-2]。由于该类药物抗菌消炎效果较好，对皮肤炎症具有一定治疗作用，因此常被不法商家违法添加在宣称具有“祛痘”或“除螨”的化妆品中，从而达到成本低、见效快的目的。然而，研究表明硝基咪唑类药物具有细胞诱变性和动物致癌毒性[3]，其代表药物甲硝唑被国际癌症研究中心列为“人类可能的致癌物”(Group 2B)。我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)(以下简称“《规范》15版”)也明确将甲硝唑列入禁用物质[4]。但目前《规范》15版收载的检测方法中仅有甲硝唑的高效液相色谱检测方法，其它品种的硝基咪唑类药物和相应检测方法尚无明确收载。这也凸显目前《规范》15版中收载大量禁限用物质却无相应检测方法的现实。因此，鉴于硝基咪唑类药物的毒性及其在化妆品中的违法添加情况，迫切需要建立相应的快速、方便、准确、易于推广的检测方法。

现有文献报道化妆品中硝基咪唑类禁用药物的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[5]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[6]和高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[7-10]。其中LC-MS/MS具有准确、灵敏和抗干扰强的优势，可应用于硝基咪唑类禁用药物的定性确证和定量分析。但以上文献报道的检测方法均仅限于单一化妆品基质，而同时分析不同基质类型化妆品中禁用药物的报道较少，因此需要探讨不同化妆品基质对检测硝基咪唑类药物的差异性。此外，样品提取和净化技术也会影响方法的灵敏度和准确性，尤其是化妆品基质中既存在水溶性的聚乙二醇、丙三醇等，又存在脂溶性的表面活性剂成分，基质效应明显，对检测结果的影响大。目前化妆品前处理技术多以普通的固相萃取小柱净化来实现[11]，但该方法实验过程繁琐、耗时长，操作不当会导致结果的重现性较差，影响实验的准确度。QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)是2003年由Anastassiades 和Lehotay提出的一种主要应用于农药残留分析的前处理技术[12]，目前QuEChERS方法包括原创方法、美国分析化学家协会标准方法(AOAC 2007.01)[13]和欧洲标准化委员会标准方法(CEN法15662)[14]。由于其具有简便、快速、环境友好、试剂消耗少等诸多优点，已经拓展应用于多领域的检测，在分析化妆品禁用物质方面也获得了较好的应用[15-18]。

本研究基于改进的QuEChERS前处理技术并结合高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)，建立了同时测定4种不同基质类型化妆品中15种硝基咪唑类禁用药物的定量方法。同时优化了QuEChERS前处理条件和色谱-质谱条件，并通过基质匹配标准曲线，消除了不同类型化妆品中基质效应的影响，保证测定结果的准确性。该方法灵敏、简便、快速，可为化妆品中硝基咪唑类禁用药物的检测提供有效的技术手段，极大提高化妆品的风险检测水平，也为国家化妆品相关检验方法的补充提供了依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290高效液相色谱仪、Agilent 6460 三重四极杆质谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；XPE 205型电子天平(瑞士梅特勒-托丽多仪器公司)；KQ-300DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Gen pure UV/UF超纯水仪(美国Thermo Fisher公司)。

对照品：4-硝基咪唑(4-HMZ，纯度99.6%，下同)、羟基甲硝唑(MNZOH，98.2%)、二甲硝咪唑(DMZ，99.4%)、洛硝哒唑(RNZ，99.1%)、异丙硝唑(IPZ，98.7%)，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；2-甲硝咪唑(MNI)、替硝唑(TNZ)、奥硝唑(ONZ)、甲硝唑(MNZ)，纯度均为100.0%，购自中国食品药品检定研究院；羟基二甲硝咪唑(HMMNI，98.0%)、塞克硝唑(SNZ，98.0%)、氯甲硝咪唑(CMNI，96.0%)，购自CNW公司；特尼哒唑(TerNDZ，99.9%)、苯硝咪唑(NBI，99.5%)，购自WITEGA Laboratorien；羟基异丙硝唑(IPZOH，99.0%，Sigma公司)。

甲醇、乙腈(德国 Merck 公司)，甲酸(美国Sigma公司)，均为色谱纯；DisQuE 萃取盐包(内含6 g硫酸镁、1.5 g 乙酸钠，AOAC法2007.01，美国 Waters 公司)；DisQuE 萃取盐包(内含4 g硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸氢二钠，CEN法15662，美国 Waters 公司);N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳(GCB)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)(天津博纳艾杰尔科技有限公司)，超纯水(18.2 MΩ·cm)由本实验室纯水仪制备，其他试剂均为分析纯。

1.2 标准溶液的制备

精密称取15种硝基咪唑类对照品10 mg置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为1 000 mg/L的单标储备液，于4 ℃冰箱保存。

分别精密量取1.0 mL 单标储备液置于50 mL棕色量瓶中，用乙腈稀释并定容，配制成质量浓度为20 mg/L 的中间浓度混合标准储备液。

使用各种空白基质提取液和中间浓度混合标准储备液，配制成质量浓度分别为5、10、50、100、500 μg/L的基质混合标准曲线工作液。

1.3 样品前处理

乳液类化妆品：称取样品0.5 g(准确至 0.001 g)于 50 mL 具塞离心管中，加入20 mL 0.1%甲酸-乙腈提取溶剂，涡旋振荡1 min混合均匀，超声提取30 min；然后加入盐析剂6 g硫酸镁、1.5 g乙酸钠，涡旋均匀，4 000 r/min离心5 min。吸取1.5 mL上清液于净化管中，加入净化剂50 mg PSA，涡旋1 min，10 000 r/min 离心5 min，吸取上清液过 0.22 μm 滤膜，进行HPLC-MS/MS分析。

水剂类化妆品：提取溶剂改为0.1%氨水-乙腈，净化剂为100 mg PSA，其余步骤同“乳液类化妆品”。

散粉类化妆品：净化剂改为50 mg PSA和50 mg C18，其余步骤同“乳液类化妆品”。

膏霜类化妆品：提取溶剂改为纯乙腈，盐析剂为4 g硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠，其余步骤同“乳液类化妆品”。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件色谱柱:XSelect CSH C18(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)；流动相：A为0.1%甲酸-乙腈,B为0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～2 min，5%A；2～17 min，5%～35%A；17～19 min，35%～95%A；19～20 min，95%A；20～20.1 min，95%～5%A；20.1～22 min，5%A，柱温：35 ℃；流速：0.25 mL/min；进样体积：1 μL。

1.4.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源(ESI+)；检测方式:多反应监测(MRM)；干燥气：氮气，温度 280 ℃，流速 14 L/min；辅助气：氮气，温度350 ℃，流速11 L/min；毛细管电压：3 000 V；离子驻留时间(Dwell time)：25 ms。相应的监测离子对(m/z)、碎裂电压和碰撞能量参数见表 1。

表1 15种硝基咪唑类化合物的MRM模式优化参数Table 1 MRM optimized parameters of 15 nitroimidazoles

*quantitation ion

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择色谱柱的填料性质及颗粒大小是影响样品组分分离度的主要因素，为获得更高的分离度、灵敏度和样品通量，本实验选择了小颗粒填料、柱效较高的4种快速分离色谱柱进行优化：A柱为Waters XSelect CSH C18(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)，B柱为Agilent ZORBAX Extend C18(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)，C柱为Agilent ZORBAX SB C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，D 柱为Waters ACQUITY HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)。结果表明，在同等色谱条件下，15种硝基咪唑类药物在A柱上的色谱峰形最优，并且经梯度洗脱获得的分离效果最理想，如图1所示，其余3种色谱柱均存在色谱峰分叉的情况。因此，最终选择XSelect CSH C18柱为最佳色谱柱。

图1 15种硝基咪唑类药物的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 15 nitroimidazolesthe number denoted was the same as that in Table 1

2.1.2 流动相的选择基于硝基咪唑类药物易溶于甲醇和乙腈，微溶于水的物理性质，选择了反相色谱常用的流动相体系甲醇-水和乙腈-水进行考察。考虑到在质谱正离子模式下，甲酸可使目标物预形成[M+H]+，有助于促进质子离子化，从而提高分析灵敏度。因此本实验着重考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水为流动相时各待测物的分离效果。结果表明，0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水为流动相体系时效果最佳、灵敏度更高，且峰形尖锐对称、分离度好。因此本实验选用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作为最佳流动相体系。

2.1.3 流速的选择在进行LC-MS/MS分析时，流速对谱峰的分离及峰形方面起着重要的作用。流速过大(在色谱柱的耐受范围之内)时，则色谱峰分离不完全；流速过小时，易造成峰形拖尾以及分析时间过长，从而降低工作效率。同时，流速的选择还应考虑离子化效率的问题。本研究分别考察了流速为0.2～0.4 mL时色谱峰的分离效果及峰形，结果表明，当流速为0.25 mL/min时，各组分的色谱峰分离较好，峰形最优，且有利于提高离子化效率。

2.1.4 柱温的选择色谱柱温度的选择不仅要考虑色谱峰的分离效果，还要考虑填料和样品的性质。分别考察了20 ℃、30 ℃、40 ℃ 时色谱峰的分离效果。结果显示，温度对15种硝基咪唑类药物分离效果的影响不明显。综合考虑，选择30 ℃作为最佳色谱柱温度。

优化条件下,15种硝基咪唑类药物的提取离子色谱图见图2。

2.2 质谱条件的优化

将对照品混合标准储备溶液用甲醇稀释成质量浓度为500 μg/L的溶液，采用MRM模式对待测物进行质谱参数优化。15种硝基咪唑类药物及其代谢物均含有氮原子，在ESI+模式下进行全扫描，可获得理想的准分子离子峰[M+H]+。以准分子离子峰为母离子，调节适当的裂解电压，选择响应值较高的两个碎片作为子离子和母离子组成离子对，同时分别优化各离子对的碰撞能量、毛细管电压、雾化气、辅助气等参数，最终获得如表1所示的质谱条件。

2.3 样品前处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂的选择硝基咪唑类药物的极性较强，常用的提取溶剂主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。考虑到甲醇和乙酸乙酯的盐析效果较差，不利于后续采用 QuEChERS 方式净化样液，因此选用乙腈作为提取溶剂作进一步考察。

图3 不同提取溶剂对4-硝基咪唑提取效率的影响Fig.3 Effects of different extraction solvents on extraction efficiencies of 4-HMZ

图4 盐析剂配方对硝基咪唑类药物提取效率的影响Fig.4 Effect of salting-out agent formulation on extraction efficiencies of nitroimidazolesA:water aqua；B:cream

由于硝基咪唑类药物具有酸碱两性化学性质，在弱酸性条件下呈质子化状态，在弱碱性条件下呈游离分子状态，因此酸碱条件对硝基咪唑类化合物的提取率影响较大。本实验选取市售阴性空白样品(水剂类、散粉类、乳液类和膏霜类)各6份，向每份空白样品中各加入400 μL 20 μg/L的15种硝基咪唑类药物混合标准溶液，涡旋振荡混匀。向每1类化妆品中分别加入 0.1%甲酸-乙腈、纯乙腈、0.1%氨水-乙腈溶液，每2份为一组平行样品，涡旋振荡混匀，定容至20 mL，经QuEChERS方式净化、过滤后，进行HPLC-MS/MS分析。考察了不同酸碱条件下目标化合物的提取效率。结果显示，在不同样品基质中，同一提取溶剂对目标化合物的提取效率有较大差异，以4-HMZ为例(图3)，在水剂类空白加标样品中，0.1%氨水-乙腈的提取效率较高，在散粉类和乳液类空白加标样品中，0.1%甲酸-乙腈的提取效率远高于其余两种。在膏霜类空白加标样品中，虽然3种提取溶剂对4-HMZ的提取效率差别不大，但对另外几种化合物的提取效率差别较大，其中以纯乙腈的萃取效率较佳。因此，综合考虑3种提取溶剂下15种硝基咪唑类药物的提取效率，水剂类样品选择0.1%氨水-乙腈作为提取溶剂，散粉类和乳液类样品选择0.1%甲酸-乙腈作为提取溶剂，膏霜类样品选择纯乙腈作为提取溶剂。

2.3.2 盐析剂种类与用量的确定QuEChERS前处理过程中加入盐析剂有利于有机相与水相分层，从而防止样品中的水分及杂质进入提取液，以提高目标物的回收率。目前QuEChERS常见的市售盐析剂配方包括经典法(4 g硫酸镁+1.5 g乙酸钠)、AOAC法(6 g硫酸镁+1.5 g乙酸钠)、CEN法(4 g硫酸镁+1 g氯化钠+1 g柠檬酸钠+0.5 g柠檬酸氢二钠)。

本实验选取市售阴性空白样品(水剂类、散粉类、乳液类和膏霜类)各3份，向每份空白样品中各加入400 μL 20 mg/L的15种硝基咪唑类药物混合标准溶液，涡旋振荡混匀。向每份样品中分别加入经典法、AOAC法和CEN法的盐析剂配方，涡旋振荡混匀，定容至20 mL，经QuEChERS方式净化、过滤后，进行HPLC-MS/MS分析。考察了不同盐析剂配方下目标化合物的提取效率。结果显示，在水剂类、散粉类和乳液类基质中使用AOAC法盐析剂配方的提取效率较高，而在膏霜类基质中使用CEN法盐析剂配方的提取效率较高(见图4)。综合考虑各种盐析剂的提取效率，选择在水剂类、散粉类和乳液类基质中加入AOAC法盐析剂配方，在膏霜类基质中加入CEN法盐析剂配方。

2.3.3 吸附剂的选择QuEChERS的原理是利用固体吸附剂选择性吸附杂质从而达到净化样品的目的，因此吸附剂的选择是一个重要的考察因素。常用吸附剂包括C18、PSA和石墨化碳(GCB)，其中C18填料是一种憎水硅胶基吸附剂，对非极性化合物具有很强的吸附性能；GCB具有六元环结构，与平面分子具有很强的亲和力，适用于多种有机化合物的提取和净化，特别适用于从基质中分离和除去有色物质和固醇类等；PSA 是同时含有伯胺和仲胺基团的高纯硅胶基质类极性吸附剂，具有极性作用和弱阴离子交换作用，可有效地去除提取液中的有机酸、脂肪酸和极性色素等水溶性杂质。

以苯硝咪唑为例，考察了单独使用C18、PSA和GCB吸附剂对15种目标化合物的提取回收率。结果表明，无论何种化妆品基质，使用GCB吸附剂的提取效率远低于其余两种净化剂。其原因可能是由于苯硝咪唑结构中含有苯环，GCB的六元环结构对其具有很强的亲和力，从而造成提取回收率下降。因此本实验不使用GCB作为吸附剂。进一步考察C18和PSA在不同组合(1∶2、1∶1、2∶1)下15种目标化合物的提取回收率，并和单独使用C18和PSA的提取回收率进行比较。结果表明，水剂类、乳液类和膏霜类基质单独使用PSA时的提取效果较好，而散粉类基质使用比例为1∶1的C18和PSA混合吸附剂时提取回收率较高。

实验还对比了不同 PSA 吸附剂用量(50、100、200 mg)对目标化合物回收率的影响。结果表明，在水剂类和乳液类基质中，不同 PSA 吸附剂用量对硝基咪唑类药物的回收率无明显影响，而在复杂的膏霜类基质中，PSA吸附剂用量为50 mg时，部分化合物的回收率明显较高。因此，综合各种吸附剂种类和用量的比对结果，水剂类化妆品选择100 mg PSA，散粉类化妆品选择50 mg PSA和50 mg C18，乳液类和膏霜类化妆品选择50 mg PSA进行后续考察。

2.4 基质效应

本实验参考相关文献对基质效应进行了考察[19-20]。取空白基质化妆品样品，加入一定量标准储备液，按“1.3”方法进行样品前处理，配成400 μg/L基质标准溶液进行分析，同时将400 μg/L标准溶液直接进样分析，计算两者目标物质谱响应的比值(ME)：ME=B/A，其中A和B分别表示分析物在纯溶剂和空白基质溶液中的峰面积。若ME>1，则表示基质对分析物的响应产生增强效应；若ME<1则表示基质对分析物的响应产生抑制效应；若ME=1，则表示不存在基质效应。计算结果表明(见表2)，15种目标化合物的响应比值为0.46～1.02，4种化妆品基质对15种硝基咪唑类药物均存在不同程度的基质效应，特别在乳液和膏霜类基质中多呈抑制效应。因此，本实验采用基质匹配的标准曲线，以减小基质效应的影响。

表2 不同基质中15种硝基咪唑类药物的基质效应、检出限及定量下限Table 2 Matrix effects,LODs and LOQs of 15 nitroimidazoles in different matrices

2.5 线性范围、检出限与定量下限

按“1.2”配制不同浓度的基质混合标准曲线工作液，依次进样，以所测目标物的峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x，μg/L)，绘制基质标准曲线，得到线性方程和回归系数(r)。实验结果显示15种硝基咪唑类药物在5～500 μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99。

根据《规范》(15版)卫生化学检测方法总则要求，定量下限(LOQ)和检出限(LOD)分别以10倍和3倍空白噪声相对应的质量或浓度表示。但由于高分辨质谱的基线噪声非常低，以S/N方法计算出的结果与真实值存在误差。因此本研究采用逐级稀释15种硝基咪唑类药物混合标准储备液的方法确定LOQ和LOD，以所测目标物峰信噪比为10∶1时的目标物浓度确定为该化合物的LOQ，以所测目标物峰信噪比为3∶1时的目标物浓度为该化合物的LOD。结果显示，15种硝基咪唑类药物的LOD为0.8～200 μg/kg，LOQ为4～400 μg/kg(见表3)。

表3 水剂类基质中15种硝基咪唑类药物的回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of 15 nitroimidazoles in the water aqua matrices(n=6)

2.6 回收率与相对标准偏差

准确称取空白水剂、散粉、乳液和膏霜类化妆品各0.5 g，平行6份，分别定量加入混合标准溶液，设定低、中、高3个浓度加标水平(0.8、4、16 mg/kg)，按照“1.3”和“1.4”方法进行样品前处理和上机测定，计算出相应目标化合物的加标回收率及相对标准偏差(RSD)。结果表明，水剂类基质、散粉类基质、乳液类基质和膏霜类基质的加标回收率分别为87.6%～115%、89.2%～113%、86.8%～110%和88.4%～115%，RSD分别为0.6%～8.0%、0.6%～8.4%、0.3%～5.4%和0.5%～7.2%，方法的准确度和精密度均符合相关法规要求。以上数据表明本研究建立的方法适合水剂、散粉、乳液和膏霜类基质的筛查测定。其中水剂类基质的加标回收率及相对标准偏差数据见表3。

图5 阳性样品的提取离子色谱图Fig.5 Extraction ion chromatogram of a positive sample

2.7 实际样品的测定

应用本方法分别对从市场收集的不同剂型、不同产地、不同品牌的87份祛痘类化妆品进行测定，其中2份样品被检出甲硝唑，含量分别为5 193 mg/kg和6 725 mg/kg。采用本方法与《规范》15版的检测结果进行对比，结果表明，本方法与标准方法的结果基本一致。阳性样品的MRM提取离子色谱图如图5所示。

3 结 论

本文建立了基于QuEChERS提取的HPLC-MS/MS测定4种不同化妆品基质中15种硝基咪唑类禁用药物的方法。实验优化了HPLC分离条件和质谱参数，针对不同的样品基质优化出最适合的提取方法和净化条件。方法学评价结果表明，该方法的加标回收率(86.8%～115%)和RSD(0.3%～8.4%)良好，15种目标化合物的检出限为0.8～200 μg/kg，定量下限为4～400 μg/kg。该方法前处理简单、准确度好、灵敏度高，适用于多种基质类型化妆品中禁用药物的检测，为化妆品安全监管提供了新的技术手段。