外源Si、NO对铜胁迫下小麦幼苗根系生长及光合作用的影响

张黛静，杨惠荔，马建辉，骆婷婷，朱群英，李春喜

(河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453000)

铜(Cu)既是植物生长发育必需的微量营养元素，又是环境污染的重金属元素。随着工业废弃物的大量排放和农用有害物质的不合理输入，Cu在土壤中的含量大幅增加，已成为土壤中主要的重金属污染物之一[1]。研究表明，植物体内过量的Cu会抑制植物的生长，而根系直接与Cu接触，最先受到毒害[2]；另外，Cu在植物体内富集进入食物链，对人类健康也会构成极大威胁[3]。因此，治理和控制土壤Cu污染一直是国内外研究的热点。

硅(Si)是植物生长发育的非必需元素，但有利于植物的生长，外源Si不仅可以缓解植物因缺Si表现出的生长缓慢，还能够提高植物对生物胁迫和非生物胁迫的耐受能力[4]。LIANG 等[5]研究表明，外源Si可以减轻Cu、Cd(镉)、Al(铝)等重金属对植物的胁迫。

一氧化氮(NO)是一种广泛存在于生物体内的气体活性分子，作为分子开关精确调控一系列细胞内的生命活动[6]。近年来的研究发现，NO 参与植物生长发育、调控非生物胁迫[7-8]。在重金属胁迫下，添加适宜浓度的外源NO能够显著增强植物的抗氧化能力，减轻氧化损伤，有效缓解植物的生长发育[9-11]。此外，NO 供体能够逆转铁(Fe)低效玉米突变体的黄化性状[12]，Fe和NO还能够形成亚硝基铁复合物降低游离Fe含量，调节植物体内Fe的稳态平衡，缓解Fe胁迫[13]。

目前，关于Si、NO缓解植物Cu胁迫的研究较少[14-15]，对于两者缓解效应的差异分析还未见报道。因此，采用水培法，以小麦幼苗为材料，在Cu胁迫下添加外源Si、NO，系统研究Si、NO对Cu胁迫下小麦幼苗根系形态、活力、营养元素吸收及叶片叶绿素含量、最大光化学效率(Fv/Fm)的影响，以期为土壤Cu污染的防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试小麦(TriticumaestivumL.)品种为矮抗58。挑选籽粒饱满、大小均匀的种子，用0.1% HgCl2表面消毒6 min，用去离子水反复冲洗干净，摆入铺有湿润滤纸、直径12 cm的培养皿中，每皿放100粒，预培养至小麦一叶一心，转至装有0.5 L Hoagland营养液的无孔花盆中，置于智能人工气候箱中进行处理。

Cu的供体为CuSO4·5H2O，Si的供体为NaSiO4·9H2O，NO的供体为硝普钠(SNP)。

1.2 试验设计

实验室前期基础研究发现，0.5 mmol/L Cu胁迫程度为中度，1.0 mmol/L Si、0.4 mmol/L NO对Cu胁迫缓解效果最好[16-17]。本试验采用水培法，设置4个处理：CK(对照，只加营养液)、Cu (0.5 mmol/L Cu)、Cu+Si(0.5 mmol/L Cu+1.0 mmol/L Si)、Cu+NO(0.5 mmol/L Cu+0.4 mmol/L SNP)，每个处理设3个重复。智能人工气候箱培养条件：光照12 h、温度22 ℃、光强250 μmol/(m2·s)，黑暗12 h、温度18 ℃，相对湿度70 %，每2 d更换一次营养液，处理后24、48、96 h取样测定相关指标。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 根系形态 各处理随机选取10株小麦幼苗，小心地取出根系，用蒸馏水冲洗干净，通过根系形态扫描仪(Epson V700)扫描根系图像，并结合WinRHIZO根系分析系统测定根系长、表面积、体积、直径。

1.3.2 根系活力 采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定小麦根系活力[18]。用去离子水冲洗干净小麦根系，取0.5 g根尖装入50 mL锥形瓶中，加入0.4%TTC溶液和0.067 mol/L磷酸缓冲液各5 mL，充分混合，置于37 ℃黑暗恒温培养箱中2 h，立即加入1 mol/L H2SO42 mL终止反应。随后，将根尖装入内含10 mL甲醇的管中37 ℃浸提7 h，在分光光度计485 nm下读取提取液的吸光度值。每个处理重复3次。

1.3.3 叶绿素含量 叶绿素含量以SPAD值表示，采用叶绿素测定仪(SPAD-502型)测定，每个叶片测定10个点取平均值，每个处理重复5次。

1.3.4 Fv/Fm 采用Poket PEA叶绿素荧光测定器对叶片Fv、Fm进行测定，夹子夹住叶片，暗反应20 min后测定，每个处理测定5次。

1.3.5 营养元素含量 取小麦幼苗的根，烘干后用研钵研磨，过0.5 mm筛后量取待测根样品0.2 g于消解管中，加入8.5 mL HNO3和1.5 mL H2O2，采用微波消解仪(CEM MARS 6,美国)消解。充分消解后于赶酸器(东方科创EHD-24,北京)上将溶液蒸发至近干，用去离子水冲洗后定容于25 mL比色管中。采用电感耦合等离子体光谱仪ICP-AES(USA, Perkin Elmer, 2100 DV)测定Cu、Si、K、Ca、Mg、Na、Fe、Mn、Zn等元素含量。元素标准品由国家有色金属及电子材料分析测试中心提供，每个处理重复3次。

1.4 数据统计分析

试验数据采用Excel 2010和SPSS 22.0进行统计分析，多重比较采用LSD法。

2 结果与分析

2.1 外源Si、NO对Cu胁迫下小麦根系生长的影响

2.1.1 根系形态 根系形态可直观地反映植物根系的生长发育状态，是评价植物对重金属耐性的重要指标。由表1可知，与对照相比，小麦根长、根表面积、根体积均在Cu处理后降低，且随处理时间延长降幅增大；根直径随处理时间延长逐渐增加。处理24 h时，在Cu胁迫下，添加Si后根长、根表面积、根体积分别提高了18.7%、27.1%、22.8%，添加NO后根长、根表面积和根体积分别提高了15.2%、16.0%、17.5%，添加Si处理小麦的根长、根表面积均大于添加NO处理，说明外源Si对小麦根长、根表面积、根体积的影响强于NO。处理48、96 h时，在Cu胁迫下，添加Si和NO均能显著提高小麦根长、根表面积、根体积，但提高程度相近，两者的作用效果没有显著差异。Cu胁迫下，施用外源Si、NO提高小麦幼苗根长、根表面积、根体积的幅度随着处理时间的推移而增大。Cu胁迫下，处理24、48 h时，添加Si、NO增加小麦的根直径；处理96 h时，添加Si、NO均显著降低了小麦的根直径，降幅分别为6.5%、7.4%，但2种外源物质间的差异没有达到显著水平。

表1 外源Si、NO对Cu胁迫下小麦幼苗根系形态的影响

注：同列数据后不同小写字母表示同一时间不同处理之间差异显著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters after data within a column mean significant differences among different treatments at 0.05 level,the same below.

2.1.2 根系活力 根系活力反映植物根系整体的发育状况，是根系生命力综合评价的重要指标。由图1可知，与对照相比，Cu胁迫显著降低了小麦的根系活力，处理24、48、96 h时分别下降了37.7%、46.0%、62.4%，说明小麦根系细胞受损，且胁迫时间越长损伤越严重。处理24、48、96 h时，与Cu处理相比，添加Si处理小麦根系活力分别提高了38.6%、33.4%、97.6%，添加NO处理小麦根系活力分别提高了31.3%、32.9%、120.9%，说明施用一定浓度的外源Si和NO可以提高Cu胁迫下小麦的根系活力，可有效缓解小麦根系的损伤。处理24 h时，添加Si处理小麦根系活力显著高于添加NO处理，但处理96 h时相反，说明外源Si、NO在不同处理时间对根系活力的作用效果不同，处理前期外源Si对根系活力的影响强于NO，随着处理时间的推移外源NO对根系活力的影响反超Si。

不同小写字母表示同一时间不同处理之间差异显著(P<0.05)，下同

2.1.3 根系营养元素含量 Cu胁迫导致植物营养元素吸收紊乱，打破植物体内离子的平衡。由表2可知，与对照相比，Cu胁迫24、48、96 h后小麦根系的Cu含量显著升高。在Cu胁迫下，添加外源Si、NO后，小麦根系Cu含量显著降低，Si处理下分别降低了45.5%、46.4%、50.9%，缓解效应随着处理时间延长而增强；NO处理分别降低了33.5%、39.5%、39.6%，缓解效应随着处理时间延长先增强后趋于稳定。添加Si处理小麦根系Cu含量均显著低于添加NO处理，表明Si抑制小麦吸收Cu的能力大于NO。Cu胁迫显著抑制了小麦根系对Ca、K、Mg、Na、Mn、Zn的吸收，但显著促进了对Si、Fe的吸收；在Cu胁迫下，添加Si、NO总体上促进了根系对Ca、K、Mg、Na、Fe、Mn、Zn、Si的吸收，并且随着处理时间的延长变化幅度总体增强。对于根系中上述元素的积累，外源Si的影响大多强于NO。如：Cu胁迫96 h时，添加Si处理小麦根系K、Mg、Mn等含量分别提高了11.4%、13.3%、64.9%，添加NO处理分别提高了9.0%、11.7%、41.5%，说明Si对K、Mg、Mn等元素含量的影响大于NO。

表2 外源Si、NO对Cu胁迫下小麦幼苗根系营养元素含量的影响

由表3可知，Cu与Ca、K、Mg、Mn、Zn间表现出拮抗作用，与Fe、Si间表现出协同作用。其中，Cu含量总体上与K、Mg、Mn、Zn含量均呈显著或极显著负相关。总体上，Mg含量与Mn、Zn含量，Si含量与Na含量均呈极显著正相关。

2.2 外源Si、NO对Cu胁迫下小麦叶片叶绿素含量及Fv/Fm的影响

2.2.1 叶绿素含量 由图2可知，Cu胁迫处理48、96 h小麦幼苗叶绿素含量显著低于对照，小麦幼苗受到一定的胁迫伤害。处理48、96 h时，添加Si、NO均可显著提高小麦幼苗叶绿素含量，对Cu胁迫造成的伤害起到一定的缓解作用，且缓解作用随着处理时间的延长而增强。值得注意的是，外源Si对Cu胁迫下小麦幼苗叶绿素含量的提高作用显著高于NO，处理96 h时，添加Si处理小麦叶绿素含量较Cu处理提高了22.2%，添加NO处理提高了13.2%。

表3 外源Si、NO对Cu胁迫下小麦幼苗根系营养元素含量之间的相关关系

注：*、**分别表示在 0.05、0.01水平上显著相关。

Note：*，** mean significant correlations at 0.05 and 0.01 levels respectively.

图2 外源Si、NO对Cu胁迫下小麦幼苗叶绿素含量的影响

2.2.2 Fv/Fm Fv/Fm表示PSⅡ原初光能转换效率。由图3可知，与对照相比，Cu处理小麦幼苗Fv/Fm随处理时间的延长呈降低趋势，但添加Si、NO后Fv/Fm显著提高，且随处理时间延长提高幅度增加。处理24、48、96 h时，与Cu处理相比，添加Si处理小麦幼苗Fv/Fm分别提高了2.9%、3.3%、5.4%，添加NO处理分别提高了3.3%、2.4%、3.9%，说明外源Si和NO均可以缓解Cu胁迫对叶绿素荧光的影响。与NO相比，Si的缓解效果略强于NO，但未达到显著水平。

图3 外源Si、NO对Cu胁迫下小麦幼苗Fv/Fm的影响

3 结论与讨论

大量研究表明，添加外源Si、NO能够缓解重金属对植物的胁迫伤害，其缓解机制主要分为2类：一是通过外排和阻止重金属吸收的避逆作用机制降低重金属在植物体内的含量；二是通过螯合作用、区隔化效应、刺激抗氧化系统等限制重金属在植物体内转移[19-20]。Si、NO能有效缓解重金属胁迫对植物的伤害，这已在小麦[21-22]、水稻[23-24]、玉米[25-26]等多种植物中得到证实。本研究发现，外源Si、NO能够减轻Cu胁迫对小麦幼苗根系形态、营养元素含量、叶片叶绿素含量及Fv/Fm的影响从而缓解Cu胁迫对小麦造成的伤害，这与前人[21-22]研究结果相似。此外，比较发现，Si对Cu胁迫下小麦幼苗整体生长的缓解效果强于NO。

根系是最先接触重金属的部位，当重金属对植物产生毒害作用时，首先会表现在根部的生理和形态改变上[27]。本研究结果表明，Cu胁迫下加入外源Si、NO能够提高小麦根长、根表面积、根体积和根系活力等，说明Si、NO可减轻Cu胁迫对小麦根系的损伤。LI等[28]研究表明，Si可缓解铅(Pb)胁迫对香蕉的胁迫伤害，与本研究结果类似，这可能是Si处理下，硅酸根离子能与重金属离子形成硅酸盐复合物，减少游离的重金属离子，影响植物对重金属的吸收，从而有效缓解重金属对植物的胁迫伤害。但有研究发现，NO可促进拟南芥根部对Cd的吸收，提高重金属毒性，这可能是由于Cd能诱导植物产生有害的内源NO[29]。而本研究中外源NO在植物体内能够通过信号分子刺激内源激素的产生促进根系生长,缓解Cu胁迫对小麦造成的伤害，造成前后结果不同的原因可能与重金属种类有关。

矿质元素不仅是植物细胞结构物质的组成成分，还是植物生命活动的调节者，调节电化学作用，维持离子浓度的平衡、胶体的稳定和电荷中和等[30]。Cu胁迫能导致植物对营养元素的积累和运输发生变化，导致营养元素失衡，代谢紊乱。本研究发现，Cu胁迫总体上导致小麦幼苗根部Ca、K、Mg、Na、Mn、Zn含量显著降低，这与张义凯等[31]Cu胁迫降低番茄根系中Ca、K、Zn含量的研究结果一致，但Mn含量的变化不同，这可能与植物种类、Cu浓度、处理时间不同有关。研究表明，Cu胁迫下添加Si或NO能降低拟南芥、番茄体内Cu含量，增加微量元素含量[32-34]。这与本研究添加Si、NO总体上可增加Ca、K、Mg、Na、Mn、Zn等元素的含量，降低Cu含量的研究结果相似。这可能是添加外源Si后，硅酸根离子与Cu离子形成不易被植物吸收的硅酸化合物，或Cu离子在植物体内代谢活性较低的细胞区室中螯合，减弱Cu与其他营养元素的竞争性吸收[32-33]。而NO则通过影响细胞壁成分，如果胶、纤维素等促使Cu离子在细胞壁积累，或促使Cu离子向液泡中转移，调控质膜上 ATPase 等功能蛋白活性、诱导基因表达等，提高Cu 胁迫下小麦根系对营养元素的吸收，从而缓解Cu的毒害[34]。此外，元素之间的拮抗或协同作用也在一定程度上调节了Cu胁迫对小麦的影响。

光合作用是植物积累干物质的基础，叶绿素是参与光合作用光能吸收、传递和转化的重要色素，其含量的高低直接反映光合作用的强弱，叶绿素含量降低是植物受重金属毒害的重要特征[35]。叶绿素荧光能够快速检测完整植株在胁迫下的光合作用，可用来评价光合机构的功能及环境胁迫对其的影响[36]，Fv/Fm是直接反映叶片叶绿素荧光特性的指标。本研究结果表明，Cu胁迫下小麦叶绿素含量、Fv/Fm显著下降，添加外源Si、NO后则显著提高。研究发现，Si能通过刺激植物的抗氧化系统减轻Cd胁迫对植物光合作用的毒害[37]；NO可以促进植物体中形成抗氧化剂而提高重金属胁迫条件下的光合作用[38]，这均与本研究结果相似。这可能是重金属胁迫降低叶绿素含量，使捕获和传递给PSⅡ反应中心的光能减少、电子传递受阻[39]，Si、NO通过减轻重金属胁迫下小麦的氧化胁迫来维持细胞器膜结构的稳定性，减轻植物叶绿体的损伤，从而保证光合作用的正常进行。