二硫键和Ca2+结合残基对重组酱油曲霉碱性蛋白酶的影响

柯 野, 谢 涛, 卫孟瑶, 樊银凤, 余 健

(韶关学院英东生命科学学院，广东 韶关 512005)

蛋白酶是非常重要的工业酶制剂之一，占有全球整个工业酶使用量的60%以上；碱性蛋白酶制剂又占整个蛋白酶制剂的一半以上，广泛应用于皮革、食品和医药等多种领域；目前商品化应用最为广泛的碱性蛋白酶制剂大部分来源于植物和细菌，较少来源于霉菌[1].在食品工业中，利用固态发酵霉菌产生的蛋白酶水解大豆制备的传统食品，具有口感丰富、风味浓郁、生理活性多样的特点，备受消费者喜爱[2].

酱油曲霉(Aspergillussojae)是传统食品发酵(如豆腐乳、米酒、酱油等)的重要菌种之一，该菌能产生多种酶类，如蛋白酶、淀粉酶和谷氨酰胺酶等[3-4].在所产生的酶中，碱性蛋白酶对传统发酵食品的风味、水解产物的脱苦味起关键作用[5-6].目前对该碱性蛋白酶的异源表达、结构与功能关系等相关研究未见报道.本课题组在前期的研究中已对酱油曲霉碱性蛋白酶(alkaline protease, Ap)基因在毕赤酵母中成功地进行了异源表达，对其酶学性质进行了研究报道[7].该酶的体外稳定性较差，通过分子定向进化增强其稳定性，是其工业化应用的前提.对于提高酶稳定性而言，增加二硫键用以提高酶热稳定性是方法之一，有研究表明[8]，增加米赫根毛霉脂肪酶中的二硫键，可提高该酶的热稳定性；同时酶结合金属离子提高热稳定性和抗水解性也是备受大家关注的[9-10].本研究在前期基础上，通过理性设计和定点突变技术，致力于探究通过增加二硫键和Ca2+结合残基提高Ap稳定性，为其工业化应用提供依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株、酶和试剂 野生型Ap的重组工程菌株和Escherichia.coliDH 5α菌株由本实验室提供；表达载体pPIC9K和毕赤酵母(Pichiapastoris) KM71菌株购自Invitrogen公司.TaKaRa MutanBEST Kit、PCR反应体系、PCR产物回收试剂盒和质粒提取试剂盒等购自宝日医生物技术(北京)有限公司.其他化学试剂均分析纯.

1.1.2 培养基E.coliDH 5α菌株采用LB 培养液培养，酵母转化子采用MD平板筛选，酵母菌采用YPD培养液培养，酵母工程菌株采用BMGY和BMMY培养液诱导表达.

1.1.3 各种引物 Ap基因的表达引物(P1和P2)和定点突变引物的序列见表1，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成提供.

表1 各种引物序列1)Table 1 Primers sequences

1)单下划线为限制性内切酶位点；双下划线为6×His tag；斜体加粗为定点突变位点.

1.2 试验方法

1.2.1 Ap基因序列及其空间结构的分析 采用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对Ap信号肽预测、SWISS MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)对Ap同源建模、Discovery studio 2.5软件和Swiss-Pdb Viewer 4.0.3等软件分析Ap序列和结构.

1.2.2 突变位点的选择 以Ap的3-D结构作为基础，利用Disulfide by Design(Version 1.20)软件对Ap中能形成二硫键的残基位点进行预测；结合模板3f7o.1.A与AP氨基酸序列的比对结果，以及3f7o.1.A自身形成二硫键的残基位点，筛选出Ap中能形成二硫键的最大可能性的残基位点.

分析3f7o.1.A中Ca2+结合的氨基酸残基，确定Ca2+结合的具体原子，再以Ap的3-D结构为基础，对Ap和3f7o.1.A中空间结构中氨基酸残基的比对，预测Ap结构中与Ca2+结合的氨基酸残基.

1.2.3 定点突变的方法 利用TaKaRa MutanBEST Kit定点突变试剂盒，按照试剂盒上的操作指导进行定点突变，然后将突变基因送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序确认.

1.2.4 突变基因在毕赤酵母中的异源表达 分别用表达引物P1和P2对T179G、D200G、T179G-D200G、G32C-S125C、S178C-T252C、G32C-S125C/S178C-T252C突变基因进行PCR扩增后，用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后的PCR产物连接至pPIC9K表达载体上，化转至E.coliDH5α中培养，提取重组质粒，SacⅠ酶线性化，电转至毕赤酵母KM71菌株中，MD平板培养筛选重组菌株，提取该菌株的基因组，基因组PCR鉴定突变基因整合至毕赤酵母基因组中的情况.将阳性酵母转化子接种至装有50 mL BMGY的500 mL三角瓶中培养2～3 d后，转接至装有50 mL BMMY的500 mL三角瓶中，每24 h向BMMY中添加1.0%(体积分数)的甲醇作为诱导剂进行诱导，诱导7 d后，8 000g离心5 min收集上清液，测定酶活性和SDS-PAGE电泳鉴定后，放置4 ℃备用.

1.2.5 Ap的分离纯化及热稳定性的测定 对Ap的纯化采用以下步骤：向1.2.4获得的上清液中，分级添加硫酸铵固体至饱和度为85%，4 ℃盐析过夜后，10 000 r·min-1离心10 min，收集蛋白沉淀.用缓冲液溶解蛋白沉淀，透析过夜获得粗酶液后，用镍柱(HisTrap FF 5 mL, GE healthcare) 进行亲和层析，然后Sephadex G-75进行分子筛层析收集洗脱液、浓缩获得重组Ap.

酶活性测定法，将纯化的Ap和底物的混合反应体系置于不同的反应温度中，测定其相应的酶活，用以探究反应温度.将Ap放置于不同的温度水浴中，处理不同时间后，测定残余酶活，以探究热稳定性；将未进行热处理的酶液作为对照，定义其相对酶活性为100%.

1.2.6 酶活性的测定 测定Ap的活性参考文献[7]中的酶活性测定法.

2 结果与分析

2.1 Ap的3-D结构分析

Ap肽链由403个氨基酸残基组成，1～20氨基酸残基序列是信号肽，21～121氨基酸残基序列是前导肽，122～403氨基酸残基序列是成熟肽，该酶是K型胞外蛋白酶.Ap的3-D结构未见报道，Ap成熟肽与PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中3f7o.1.A(来源于Paecilomyceslilacinus)的同源性高达53.79%[9]，根据同源性达到30%以上就可建模的理论，Ap以3f7o.1.A为3-D结构模板，采用Ramachandran对主链ψ和φ角的合理性分析，结果表明模拟的Ap结构合理(图1).预测Ap的3-D结构是其肽链124～402序列，便于下文叙述，以该结构的第1个氨基酸残基序号(Ap肽链中124位点氨基酸残基)定义为1，余下序号以此类推.由图1可见，Ap为单体酶，包括7个α螺旋、2个310-螺旋和15个β折叠，活性位点(催化三联体)分别是D39/H70/S226.在3F7O.1中有1个Ca2+结合，结合残基分别为Glu177、Val180、Leu201主链中的羰基氧，以及T182侧链基团O1和D203侧链基团的O2.Ap和3f7o.1.A的Ca2+结合空间结构，与图2相比可知，在Ap中与Ca2+结合的残基为A174、A177、V198、T179和D200，T179和D200位点的氨基酸残基非常保守，由于T和D的侧链O基团对Ca2+结合作用尤为重要.在模板3F7O.1中具有5个C残基，其中4个C残基(即C126-C36和C181-C253)之间分别形成了2对二硫键；而Ap中无C残基，无二硫键形成.

图1 Ap的3-D结构模型
Fig.1 3-D structure model of Ap

图2 Ap(黑色)和3f7o.1.A(红色)中Ca2+结合位点的对比分析
Fig.2 Comparative analysis of the Ca2+binding sites between Ap (black) and 3f7o.1.A (red)

2.2 突变位点的确定以及定点突变结果

利用Disulfide by Design软件预测Ap中可能形成二硫键的氨基酸残基共56对(表2)，结合模板3f7o.1中二硫键的形成情况，Ap中最有可能形成二硫键的氨基酸残基为34～123和78～252.对该4个残基进行突变，获得Y34C-R123C、L178C-T252C、Y34C-R123C/L178C-T252C共3个突变基因，测序确认突变成功.

据2.1中Ap结构分析，Ap的2个残基T179和D200的侧链基团O与Ca2+结合；将该2个残基分别突变为无侧链基团的G残基，共获得3个突变基因，即T179G、D200G、以及T179G/D200G的突变基因，测序确认突变成功.

表2 运用Disulfide by Design软件预测在Ap形成二硫键的氨基酸残基对Table 2 Predictions of amino acid residue pairs forming disulfide bonds in Ap using Disulfide by Design software

2.3 二硫键突变对Ap的影响

Y34C-R123C、L178C-T252C突变型均能在重组工程菌株中成功表达，分泌到发酵液中；突变型与野生型的发酵液中的酶活性差异不显著，这表明增加1个二硫键对Ap表达不影响.

Y34C-R123C/L178C-T252C突变型不能在重组工程菌株中成功表达，这可能与Ap的折叠过程相关.由于蛋白质在成熟折叠过程中，一级肽链结构中相距越近的半胱氨酸残基间，越易形成巯基组合的分子异构体，这种异构体又促进蛋白质的进一步折叠，但该异构体结构不稳定；当蛋白质再折叠后，构象有序性获得加强，致使巯基组合解开，仅有接近天然构象的柔性巯基才能靠近，形成正常天然的二硫键，再促使蛋白质的正确折叠，形成稳定的蛋白结构[11-12].Y34C-R123C、L178C-T252C突变型均能表达，但是Y34C-R123C/L178C-T252C突变型不能表达，这可能是由于R123C和L178C残基在一级结构上相距较近，形成了错误的巯基异构体，但野生型Ap中没有二硫键，导致该巯基结合不能断裂，致使Ap不能进行进一步的正确折叠，导致降解不能被成功表达.

M:蛋白质分子质量标准物;1:发酵上清液;2:镍柱亲和层析洗脱液;3:凝胶层析洗脱液.图3 重组Ap的电泳图Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant Ap

分别将野生型Ap、Y34C-R123C和L178C-T252C突变型从发酵液中盐析沉淀出，镍柱亲和层析、Sephadex G-75的分子筛层析后，获得电泳级纯度(图3).

对野生型、Y34C-R123C和L178C-T252C突变型Ap的反应温度和热稳定性进行比较探究.由图4可知，3种酶虽然最适反应温度均为45 ℃，但Y34C-R123C突变型在50 ℃和55 ℃的反应温度下的相对酶活均高于野生型和L178C-T252C突变型；进一步对热稳定性比较，图5可见，Y34C-R123C突变型在40 ℃处理100 min后残余酶活(约56%)高于野生型(约34%)的残余酶活性22%，通过反应温度和热稳定性结果可见，Y34C-R123C突变型结构中，形成了二硫键结构提高了Ap的稳定性；由图1可见R123残基位于连接二级结构的LOOP环上，Y34处于Ap的无规则卷曲区，通过C34-C123形成的二硫键增强了Ap该无规则卷曲区域结构的稳定性，从而提高了Ap的耐热性；该结果与杨倩等报道相似，即对米根霉的α-淀粉酶，采用增加氢键来提高酶中无规则卷曲构象不稳定区域的稳定性后，提高了该酶的热稳定性[13].

L178C-T252C突变型在反应温度和热稳定性方面都表现出弱于野生型.这可能由于L178和T252残基分别在相对较为刚性的β折叠和α螺旋上，C178-C252间形成了二硫键，对β折叠和α螺旋结构有一定的影响，导致突变型Ap的热稳定性降低.

2.4 Ca2+结合残基突变对Ap的影响

3个Ca2+结合残基的突变型基因(T179G、D200G、T179G/D200G)在工程菌株的发酵液中都未检测酶活性，并且发酵液的SDS-PAGE电泳图谱中也未有相应的重组蛋白酶条带，这表明3种突变型的Ap均不能在重组毕赤酵母菌株中成功表达.该结果与2.1中Ap结构分析一致，这表明T179、D200残基的侧链O对Ca2+的结合至关重要.

图4 重组Ap野生型和突变型的最适反应温度
Fig.4 Effects of different reaction temperature on the
recombinant Ap and mutants

“—”野生型;“┄”Y34C-R123C突变型;“…”L178C-T252C突变型.
图5 重组Ap野生型和突变型的热稳定性
Fig.5 Thermostability of the recombinant Ap and mutants

金属离子对酶活性质的影响研究较受大家的关注，有研究表明[14-15]位于α-淀粉酶BLA的结构域A、C之间的钙离子结合，对维持BLA稳定性非常重要.在α-淀粉酶中增加Zn2+结合位点，得到了在80 ℃情况下耐热稳定性提高4.5倍的突变型[16].这些研究表明金属离子对酶的影响重要性，在本研究中，对于野生型Ap在EDTA金属螯合剂存在的情况下，酶活性下降约15.2%，这表明在EDTA存在下Ca2+被夺走，对Ap酶结构有影响，导致酶活性下降.突变型T179G、D200G、T179G/D200G不能结合Ca2+，导致Ap局部空间结构不能稳定，致使整个Ap不能正确的折叠，不能形成正确成熟的Ap结构，不能成功表达.这表明T179、D200是Ap中的Ca2+高亲和力结合位点，对Ap的正确折叠和维持成熟稳定的活性起到非常重要的作用.

3 结论

对蛋白质结构热稳定性影响的因素较多，如氨基酸残基的疏水作用、盐键、氢键和二硫键等，不同结构类型的蛋白质受到具体因素的影响程度具有差异[13].在本试验中，采用理性设计在Ap酶中引入二硫键的突变型，获得热稳定性增强的Y34C-R123C突变型，也获得稳定性相对减弱的L178C-T252C突变型，以及不能成功表达的Y34C-R123C/L178C-T252C突变型.结果表明，在Ap酶中增加二硫键以提高其稳定性的方法可行，对于确定增加二硫键的具体位点非常关键，应尽量选择酶结构中无规则卷曲等构象相对不稳定的区域进行设计.

对Ap酶中预测可能参与Ca2+结合的氨基酸残基进行突变，将含有侧链基团O的氨基酸残基突变为无侧链基团的G，这导致突变型T179G、D200G、T179G/D200G不能成功表达，这表明T179和D200残基对Ca2+结合到Ap中至关重要，同时Ca2+对Ap的正确折叠、形成成熟的活性酶具有重要作用.本试验对Ap类蛋白酶及其他酶的结构与功能关系的研究提供了依据.