福建柏在盐胁迫下的应答蛋白

杨德明, 张娅欣, 刘晓颖, 陈 乾, 荣俊冬, 郑郁善

(1.福建农林大学林学院;2.福建农林大学竹类研究所，福建 福州 350002)

福建柏[Fokieniahodginsii(Dunn) Henryet Thomas]是柏科福建柏属常绿树种，其树形优美，木材质地良好，可耐受贫瘠，叶片可提炼精油，是南方广泛栽培的造林树种[1].盐害是影响福建柏分布的主要非生物胁迫因素.蛋白是基因功能的执行者，从蛋白角度研究福建柏在盐害下的生命活动，即对福建柏响应盐胁迫、相关抗盐代谢的蛋白组成、盐胁迫下基因的转录调控，以及蛋白质翻译后修饰的变化规律进行研究[2].植物应答盐胁迫的蛋白主要是感受信号以及适应胁迫[3].游离钙离子浓度变化被认为是植物在受到胁迫时的一种感知信号，在高盐胁迫下参与钙离子运输以及维持细胞膜稳态的相关蛋白响应表达[4].胁迫感知信号被传递到不同的细胞器中.盐胁迫会使得一些蛋白质错误折叠，造成三维构象的混乱，这能被内质网膜上特定的受体蛋白感知并产生内质网胁迫，致使相关PKR类激酶以及分子伴侣大量表达[5].光合电子传递的复杂性使其对环境变化较为敏感，叶绿体功能代谢产生超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基和单线态氧等，并引起相关蛋白的差异表达[6].与叶绿体类似，线粒体和过氧化物酶体可产生ROS和许多代谢物，其中一些可能作为逆向信号分子[7].参与次级信号传导的MAP激酶途径家族成员众多，在植物盐胁迫中可发现多个MAPKs激酶的迅速表达[8].研究[9]表明脱落酸的信号转导是植物在盐害条件下的核心信号调节.研究[10-11]表明包括START结构域的蛋白家族可作为ABA的受体.植物受到盐害后出现ABA相关代谢途径的蛋白表达.

双向电泳最早由O′Farrell′s[12]于1975年提出，利用蛋白质的等电点以及分子量对蛋白质进行分离.通过不断的技术改进，在有效分离蛋白质的同时解决了实验重复性差的问题[13].同时通过更灵敏的染色方法，使得双向电泳的高分辨率以及可重复性得到应用，是研究蛋白质组学的经典方法[14].对福建柏响应盐胁迫差异蛋白质组学的研究未见报道.本文利用双向电泳技术对福建柏叶片响应盐胁迫蛋白质进行研究，为福建柏耐盐途径及其遗传改良研究提供依据.

1 材料与方法

1.1 盐胁迫处理

福建柏材料为本实验室培育的无性扦插植株.参考吴文锦等[15]的方法，本试验设置50 mmol·L-1NaCl和100 mmol·L-1NaCl处理，每组设3次重复.处理时间为14 d，浇水强度为保持土壤湿润，植株放置盆托以保证水分不会流失.处理完毕后在不同高度剪下福建柏的叶片,用超纯水洗净擦干后再用锡纸包好放入液氮速冻.并置于-80 ℃保存.

1.2 蛋白质提取

参考试验前期的优化结果[16]，采用三氯乙酸/丙酮法[17]提取福建柏叶片蛋白，叶片在液氮中磨碎后转移至PE管中，加入含10%(体积分数)三氯乙酸的丙酮，使蛋白沉淀；离心后去上清液，用丙酮清洗数次以减少色素等杂质.加入用Tris饱和酚溶液抽提的蛋白，离心后取“酚相”转移至新管，并加入0.1 mol·L-1醋酸铵甲醇溶液沉淀；离心后去上清，并风干，得到蛋白干粉，置于-80 ℃冻存.

1.3 电泳

表1 等点聚焦仪器参数设定Table 1 Setting of isoelectric focusing apparatus

等电点电泳胶条：选择Bio-Rad公司生产的17 cm、pH 4～7 的IPG胶条.等电聚焦参数设定见表1.等点聚焦完后经以下两步平衡胶条[18]，第一步：加入平衡缓冲液(36%(质量分数)尿素+2%(质量分数)SDS+6.5%(质量分数)Tris-HCl (pH 8.8)、20%(体积分数)甘油+2%(质量分数)DDT)平衡15 min后丢弃平衡液.第二步：加入平衡缓冲液(36%(质量分数)尿素+2%(质量分数)碘乙酰胺+2%(质量分数)SDS+6.5%(质量分数)Tris-Hcl (pH 8.8)、20%(体积分数)甘油)平衡15 min.最后将胶条转移至10%(体积分数)聚丙烯酰胺凝胶中进行垂直电泳分离.

1.4 银染染色与质谱鉴定

参考Blum et al[19]的方法，并作适当修改，用20%(体积分数)冰乙酸固定1 h后再用20%(体积分数)酒精漂洗15 min，敏化5 min，敏化液包括0.8 mol·L-1醋酸钠、0.015 mol·L-1硫代硫酸钠、30%(体积分数)乙醇，再用超纯水洗15 min(中途换水2次)；水洗后采用0.015 mol·L-1硝酸银+0.04%(体积分数)甲醛染色，再水洗2次，每次1 min；用显色液(0.25 mol·L-1碳酸钠+0.02%(体积分数)甲醛)显色3～5 min，待蛋白染上色后用终止液(0.04 mol·L-1乙二胺四乙酸二钠)终止反应，水洗后进行扫描凝胶分析(表2).采用PDQuest分析软件进行2-DE图谱分析.将差异蛋白挖取后采用ABSCIEX生产的质谱仪(5800MALDI-TOF)进行肽段指纹图谱的收集.通过Mascot数据库进行肽质量指纹谱查询.

2 结果与分析

2.1 双向电泳结果与差异蛋白的质谱鉴定

采用PDQuest软件检测盐胁迫下双向电泳丙烯酰胺凝胶图谱(图1).通过3次重复及有效性T检验发现，99%的差异蛋白中共选取2倍以上差异且背景清晰的蛋白21个，其中16个蛋白在盐胁迫中上调表达，5个蛋白在胁迫中下调表达.其中上调蛋白中多数差异蛋白集中在酸性端中部；而下调蛋白分布较均匀，没有明显规律.

通过双向电泳找出的21个差异蛋白进行质谱分析，成功检测20个蛋白，经过Mascot数据库检索后得到相应的蛋白编号(表2).

A.50 mmol·L-1 NaCl;B.100 mmol·L-1 NaCl;C.对照组(CK);D.上调蛋白;E.下调蛋白.图1 双向电泳凝胶图Fig.1 Bidirectional electrophoresis gel diagram

2.2 差异蛋白代谢通路分析

通过差异蛋白代谢通路分析发现，盐胁迫引起福建柏的一系列功能变化，出现碳固定、碳代谢、甘油二酸阴离子代谢、丙酮酸代谢、光合作用、丙醇代谢、半胱氨酸氮氨酸代谢、氧化磷酸化、TCA循环、氨基酸合成、木质素生物合成等相关蛋白(图2)，表明盐胁迫造成福建柏大量代谢通路在抵抗盐害过程中受到影响.

图2 差异蛋白代谢通路分析Fig.2 Pathways analysis of differential proteins

3 讨论

碳代谢作为基础代谢参与生命活动的各个时期[20]，本研究结果表明40%差异蛋白与碳代谢相关，说明盐胁迫致使福建柏通过大量生命活动来调控盐害.盐胁迫对植物光合作用的影响主要是气孔开度变小，气孔导度降低导致CO2进入量变少，从而影响碳固定过程.而在盐胁迫下植物叶片光反应结构位点被破坏而引起光合速率降低[21-22].福建柏在盐胁迫下15%差异蛋白与碳固定以及光合作用相关，可以推测福建柏的光合速率与碳固定同样受到了胁迫的影响.植物在受到盐害时由于光合速率受到抑制，抗氧化以及渗透作用增强，光合成速率降低，分解速率增大[23].10%差异蛋白与TCA代谢有关，10%差异蛋白与氧化磷酸化相关，这些途径都与能量代谢有关，表明福建柏在盐胁迫下能量代谢剧烈变化，推测福建柏在抵抗盐害过程中需要大量的能量.10%差异蛋白与木质素合成相关.研究发现植物在盐胁迫下与木质素和果胶相关的酶功能以及细胞壁变化是植物应对盐害的机制[24].对盐胁迫差异蛋白代谢通路分析发现，盐害大多与能量代谢有关，这与陈思凯等[25]对大头典竹盐胁迫的研究结果一致，可能是因为在抵抗盐害过程中消耗了更多的能量.同时氧化磷酸化的差异代谢与张振亚等[26]对南方型紫花苜蓿在盐胁迫下的差异蛋白研究结果一致，说明福建柏在盐胁迫下能量代谢的变化与南方型紫花苜蓿有相似的调节方式.在对福建柏进行双向电泳的蛋白质组学研究中，发现一些步骤会影响双向电泳结果，比如在IPG胶条的水化过程中，水化的时间以及蛋白液的体积对胶条吸收的蛋白量有一定影响[27].在盐胁迫的时间处理中，为获得稳定表达的蛋白，本研究的处理时间为两周，可能造成一些与信号传导相关的蛋白以及转录因子类的蛋白没有被检测到.

表2 凝胶蛋白编号以及NCBI登录号Table 2 Gel protein numbers and NCBI codes

本研究利用双向电泳技术研究福建柏响应盐胁迫的有关蛋白，共鉴定到差异蛋白21个，其中16个在响应胁迫过程中的表达量得到了上调，5个蛋白在响应胁迫中表达量下调.通过质谱鉴定以及代谢通路的分析，发现福建柏在盐胁迫过程中，碳固定、碳代谢、甘油二酸阴离子代谢、有机物光合作用碳固定、TCA循环、木质素生物合成、氧化磷酸化及半胱氨酸代谢这几个方面出现较大变化.