IL-28B基因rs12979860基因多态性与慢性丙型肝炎转归的关系

蔡博 刘晓丹 王小青

据世卫组织报道，全球丙型肝炎感染者占比约为3%，慢性感染者高达1.7亿，其中自发性清除者约为20%～30%，持续感染者约为70%～80%[1]。若未能及时治疗，在持续病毒感染的情况下极易进展为肝硬化，甚至引起肝细胞癌，增加死亡率。IL-28B以IFN-λ3为表达产物，它能将JAK-STAT通路激活，并调节机体免疫。近年来，研究发现IL-28B基因多态性可能与慢性丙型肝炎(CHC)自发清除效果存在关联，但其与肝功能、脂代谢转归的关系尚未明确[2]。本研究旨在分析IL-28B基因rs12979860位点多态性与CHC转归的关系，为该病治疗提供新的治疗方向，现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

选取山东省聊城市第二人民医院2014年8月—2017年8月收治的CHC患者130例，均给予抗病毒治疗。其中男69例，女61例，年龄30～72岁，平均(49.76±14.39)岁；体质指数18～25 kg/m2，平均(21.32±2.14)kg/m2；病程2～7年，平均(4.34±1.32)年；家族史：有26例，无104例；HCV基因型：Ib型118例，非Ib型12例；饮酒史：有41例，无89例。研究方案获得本院伦理委员会批准。

二、诊断标准[3]

(1)有CHC症状体征，包括恶心、腹胀、发热、黄疸等；(2)HCV阳性≥6个月；(3)HCV RNA呈阳性；(4)血清检查提示谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)增高。

三、纳入与排除标准

(1)纳入标准 ①临床诊断明确；②接受12个月的抗病毒干预；③既往无免疫调节剂应用史；④知情同意。

(2)排除标准 ①合并甲亢、恶性肿瘤；②妊娠、哺乳期妇女；③肝硬化；④因酒精、药物所致肝病；⑤糖尿病；⑥高血压；⑦精神病史。

四、方法

(1)分组方法 根据患者12个月后的抗病毒疗效，分为转归良好组、转归不良组。评价标准[3]：①转归良好：经干扰素等干预12个月，获得部分病毒学应答或完全应答；②转归不良：经干扰素等干预12个月，未能获得病毒学应答。

(2)基因多态性测定 主要试剂包括PCR引物、琼脂糖、乙醇、DNA提取试剂盒、探针。主要仪器为离心机、电泳仪、水浴槽、分光光度计、成像系统、移液器、PCR仪。DNA提取：①采集4 mL静脉血，抗凝；②取20 μL蛋白酶K加入，加200 μL结合液，混匀，水浴(恒温70℃)10 min，待其颜色变得清亮；③取异丙醇200 μL，混匀，于收集管内置入吸附柱，倒入反应溶液，离心30 s(10 000 rmp)；④弃废液，取去除液400 μL倒入，离心30 s(12 000 rmp)；⑤再次弃废液，取漂洗液600 μL倒入，离心30 s(12 000 rmp)；⑥再次弃废液，下调水浴箱温度(68 ℃)，加漂洗液500 μL，离心30 s(12 000 rmp)；⑦弃废液，离心120 min(11 000 rmp)，彻底清除漂洗液；⑧取新的离心管，置入吸附柱，对洗脱缓冲液进行预热，取50 μ洗脱缓冲液倒入，室温下等待3 min，离心60 s(12 000 rmp)，将溶液置于吸附柱，反应2 min，离心60 s(10 000 rmp)。

完成DNA提取后，取1 μL样本行质量鉴定，给予凝胶电泳，并稀释为5～10 ng/μL。具体如下：①按照所需量对琼脂糖粉进行称重，并倒入电泳缓冲液；②将溶液加热使其完全溶解，时间为2 min，溶液变成透明色；③冷却，使溶液降至60 ℃，按照1 μL/1 mL比例取溴化乙锭EB加入，混匀；④倒入橡胶胶膜(内含梳子)，观察梳子齿间、齿下有无气泡；⑤等待凝固，时间为25～30 min，将梳子撤除，使凝胶入电泳槽；⑥取电泳缓冲液加入，直到其高于胶面1 mm；⑦取样品2 μL倒至样品槽；⑧经成像系统进行分析，并获得图像。本研究主要分析rs12979860位点，包括TT、CT、CC三种基因型。

(3)血清学测定 在入院当天采集静脉血4 mL，离心20 min，转速为3 000 r/min，分离血清，测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TB)、白蛋白(Alb)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(TC)水平，仪器为日本东芝TBA-40FR全自动生化分析仪。

五、统计学方法

结 果

一、患者转归情况分析

在130例患者中，转归良好101例，占77.69%，转归不良29例，占22.31%。根据疗效分成转归良好组、转归不良组。

二、rs12979860分型与预后的关系

转归良好组CC型90(89.11)例，CT型11(10.89)例，转归不良组CC型17(58.62)例，CT型12(41.38)例。转归良好组CC型占比高于转归不良组(χ2=14.382，P=0.000)，见表1。

三、两组肝功能、脂代谢比较

转归良好组的HDL高于转归不良组，其余各指标低于转归不良组(P<0.05)，见表1。

四、rs12979860分型与肝功能、脂代谢的关系

据表2得知CC型107例，CT型23例。CC型患者血清HDL高于CT型，其余各指标低于CT型(P<0.05)，见表2。

讨 论

本研究发现130例患者经抗病毒干预后，有101例疗效良好，且疗效良好者的rs12979860位点CC基因型占比高于疗效不良者，提示其基因分型可能影响CHC抗病毒疗效。rs12979860是IL-28B基因的一个位点，有研究提示IL-28B基因变异对病毒性肝炎疗效影响较大，带有保护性基因的病毒学应答率高于无保护性基因者[4]。然而，既往研究关于IL-28B基因对抗病毒疗效的影响机制尚未完全明确。从本研究结果来看，在IL-28B基因位点中，rs12979860位点的CC基因型为保护性基因，具有宿主保护功能。有学者发现该位点的CC基因型能反映肝小叶炎症程度，它可降低肝细胞脂肪变性风险，对肝脏有保护作用[5]，这为本研究开展提供了理论依据。研究表明在欧裔美洲人中，该位点CC基因型占比约33%，而亚洲人群的该位点CC基因型占比非常高，如日本约为84%，这类患者的预后往往也更为理想[6]。本研究也证实CHC患者rs12979860位点以CC基因型为主，且预后较好。因此，在日后的治疗中，医师可通过测定该位点的基因分型预测预后。

表1 两组肝功能、脂代谢比较(±s)

表2 rs12979860分型与肝功能、脂代谢的关系(±s)

通过观察两组患者的肝功能、脂代谢，发现转归良好组的肝功能、脂代谢改善较转归不良组更显著，与既往研究[7]基本相符。本研究创新之处在于分析rs12979860分型与肝功能、脂代谢的关系，发现带有CC基因型的患者肝功能、脂代谢改善较带有CT基因型的患者更显著。研究表明CHC患者肝功能、脂代谢异常可能与机体炎症反应有关，随着机体炎症反应越重，对肝功能损害越重，脂代谢紊乱更难以纠正[8]。另有研究提示rs12979860位点的CC基因型能影响肝脏炎症程度，在肝脏出现炎症前，该位点CC基因型便能提前预测，有利于保护肝脏[9]。因此，笔者推测带有CC基因型的患者可能因对肝脏有保护作用，从而缓解炎症，更利于改善肝功能与脂代谢。研究表明IFN-λ3作为IL-28B的表达产物，当IL-28B基因多态性改变后，IFN-λ3也会发生相应变化，而IFN-λ3具有调节免疫的作用，且具备抗病毒功能[10]。鉴于此，笔者推测CC基因型对肝脏的保护作用可能与IFN-λ3的免疫调节、抗病毒作用相关。

综上，IL-28B基因rs12979860位点的基因分型与CHC患者转归密切相关，其中带有CC基因型的患者转归更好，它对改善肝功能、脂代谢有益，临床可据此研究出新的治疗方向。此外，本研究也有不足，如仅选取130例样本，病例数少，未来将扩大样本量分析其他位点的基因分型情况。