外周血γδT细胞在评估Peg-IFN α-2a治疗慢性乙型肝炎效果中的应用价值

支星 颜学兵

近年来，聚乙二醇干扰素(Peg-IFN)α-2a在慢性乙型肝炎(CHB)治疗中被应用，与常规α-干扰素相比，Peg-IFN α-2a的耐药率更低，疗效更可靠[1-2]。γδT细胞是比较特殊的一类T淋巴细胞，其组成部分包括γ链与δ链，既往有研究发现，γδT细胞在外周血中的异常表达参与了肝炎进展过程，如对慢性丙型肝炎患者而言，其外周血γδT细胞持续异常与肝脏炎症程度密切相关[3]。本研究分析外周血γδT细胞在评估Peg-IFNα-2a治疗CHB效果中的应用价值，旨在进一步了解Peg-IFN α-2a的临床疗效及外周血γδT细胞对CHB疗效的影响。

资料与方法

一、一般资料

回顾性分析我院2016年4月—2018年4月收治的106例CHB患者的临床资料，其中男59例，女47例，年龄32～74岁，平均(52.53±12.16)岁；病程1～5年，平均(3.41±1.37)年；肝纤维化程度：S1期15例、S2期41例、S3期38例、S4期12例；炎症程度：G1级14例、G2级45例、G3级35例、G4级12例。

二、纳入与排除标准

(一)纳入标准 (1)参考相关诊断标准确诊为CHB[4]，诊断明确；(2)入院前6个月内无抗病毒治疗史；(3)病例资料完整；(4)入院后接受Peg-IFNα-2a治疗；(5)遵循医嘱定期入院复查。

(二)排除标准 (1)合并血液性疾病；(2)糖尿病患者；(3)既往有精神病史、神经病史；(4)妊娠、哺乳期妇女；(5)肾、心、脑等器官损害；(6)其他类型的肝病，如甲型肝炎、丙型肝炎等。

三、方法

(一)治疗方法 所有患者均给予Peg-IFNα-2a(派罗欣，罗氏制药，国药准字J20120075)治疗，每次180 μg派罗欣皮下注射，每周1次，治疗12个月。在治疗期间，患者每隔3个月入院复查一次，必要情况下进行降酶药物干预，期间不采用其他药物治疗。

(二)检测方法

1.乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)检测：选取3 mL空腹静脉血，经高压灭菌后置于EP管内，利用实时荧光定量PCR法测定血清HBV DNA水平，试剂盒源于生工生物，严格根据试剂盒完成操作。反应条件：37 ℃ 120 s，94 ℃ 120 s，(93 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，循环40次)。

2.外周血γδT细胞检测：主要仪器为酶标仪(生工生物)、培养箱(上海森信)、流式细胞仪(贝克曼)，主要试剂为小牛血清(江苏宝莱)、酶联免疫试剂盒(生工生物)、rhIL-2(江苏宝莱)、RPMI1640(江苏宝莱)。采集4 mL空腹静脉血抗凝，将单个核细胞分离出来，经磷酸盐缓冲液进行洗涤，对白细胞予以收集，使其浓度为1 106个/mL，接入24孔板进行培养，分别加入IPP、rhIL-2，其中rhIL-2每隔2 d补加一次。按照细胞具体的增殖状态分孔培养。经Hanks液体进行3次冲洗，使细胞浓度调整为5 106个/mL，取细胞悬液100 μL加入流式管，取0.5 μg抗人TCR-γδ-FITC加入，充分混合，在4 ℃条件下反应30 min，离心、洗涤，经流式细胞仪测定。

四、观察指标

根据患者治疗12个月后的临床疗效分为病毒学应答组、病毒学无应答组，比较病毒学应答组、病毒学无应答组的外周血γδT细胞、HBV DNA水平。病毒学应答[4]：采取荧光PCR法检测HBV DNA，<300拷贝/mL则为病毒学应答，其他为无应答。

五、统计学方法

结 果

一、106例患者的治疗效果分析

在106例CHB患者中，病毒学应答85例(80.19%)，病毒学无应答21例(19.81%)。

二、两组外周血γδT细胞、HBV DNA水平比较

治疗前，病毒学应答组、病毒学无应答组的外周血γδT细胞分别为(5.62±0.98)%、(5.60±0.95)%，治疗后分别为(2.39±0.62)%、(5.58±0.91)%。治疗前，病毒学应答组、病毒学无应答组的HBV DNA分别为(6.43±1.02)lg拷贝/mL、(6.45±1.04)lg拷贝/mL，治疗后分别为(3.32±0.73)lg拷贝/mL、(6.41±0.99)lg拷贝/mL。两组治疗前外周血γδT细胞、HBV DNA比较差异无统计学意义(P>0.05)，病毒学应答组治疗后外周血γδT细胞、HBV DNA低于治疗前及病毒学无应答组(P<0.05)。

三、外周血γδT细胞对CHB疗效的评估价值分析

外周血γδT细胞评估CHB疗效的曲线下面积为0.653(标准误=0.061，P=0.012，95%CI=0.534～0.772)，最佳截断值为4.11%，敏感度为60.06%，特异度为58.90%。ROC曲线见表1。

图1 外周血γδT细胞评估CHB疗效的ROC曲线

讨 论

约1%～5%CHB患者发展成原发性肝癌[5]。为了改善患者预后，本研究针对CHB患者采用Peg-IFNα-2a治疗，结果提示在106例患者中，总病毒学应答率为80.19%，与相关研究结论基本吻合[6]。Peg-IFNα-2a将普通干扰素、聚乙二醇相结合，可促使干扰素药物特性出现变化，延长半衰期，提高血药浓度的稳定性，能更持久地抑制HBV DNA，每周给药1次即可，且治疗安全性高。研究表明Peg-IFN α-2a的病毒抑制效果优于普通干扰素，且不会增加不良反应[7]。这进一步证实该药在CHB中适用。

本研究提示，病毒学应答组治疗后的外周血γδT细胞、HBV DNA水平较治疗前明显降低，且低于病毒学无应答组，提示二者在血液中的表达水平与患者的临床疗效密切相关。有研究者以慢性丙型肝炎患者为研究对象，发现γδT细胞在这类患者外周血中呈高表达，抗病毒干预时间越长，患者的外周血γδT细胞水平越低[8]。本研究通过绘制ROC曲线，证实外周血γδT细胞对CHB患者的抗病毒疗效也具有评估价值，创新之处在于明确了曲线下面积、最佳截断值以及相应的敏感度、特异度，提示以外周血γδT细胞>4.110%时，患者经Peg-IFN α-2a治疗病毒学无应答的风险越高。

本研究发现CHB患者的外周血γδT细胞与HBV DNA呈正相关，表明随着外周血γδT细胞水平越高，患者HBV DNA也相应增加，提示病情越重。在经Peg-IFN α-2a治疗后，患者的外周血γδT细胞水平下调，HBV DNA也相应下调，提示病情缓解。基于此，临床医师可将外周血γδT细胞、HBV DNA共同作为评估CHB患者病情的重要指标，便于进一步评估临床疗效，改善预后。