SPME-GC-MS 结合电子鼻技术分析不同品种猕猴桃酒香气物质

赵 宁，魏新元，樊明涛*，张 杰，戚一曼，徐俊南，张 利

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

猕猴桃（Actinidia chinensis Planch），又称羊桃、奇异果、长寿果等[1]，是猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia）的浆果类果实[2]，其营养丰富，利用价值高[3-5]。成熟果实柔软多汁，酸甜适口，风味独特；除鲜食外，可制成果酒、果汁及果脯等产品[6]。猕猴桃酒营养丰富，清亮透明，酸度适宜，有较强抗氧化活性等保健功能[7]，深受消费者喜爱。除营养物质外，香气特性也是评价猕猴桃酒品质的重要指标，其可影响消费者的接受度和整体评价。但是，目前关于猕猴桃酒的研究主要集中在酿造工艺优化、抗氧化性及原酒后处理等方面[8]，对不同猕猴桃酒间香气特性比较的报道较少。

固相微萃取-气相色谱-质谱（s o l i d p h a s e microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）联用和电子鼻技术是研究食品中挥发性香气物质的常用有效手段。GC-MS技术有检测灵敏度高、操作快速、结果准确等特点，而且有标准质谱库可供检索，是定性和定量的优良工具[9]。电子鼻技术是基于气体传感阵列响应图谱识别气味的电子系统，是一种用途广泛、实时快速无损的风味物质分析检测方法[10-11]；该技术已用于乳制品[12]、肉制品[13]、食用油[14]、酒[15]、水果[16]、果汁[17]及茶[18]等食品的风味分析中。然而，目前鲜见利用电子鼻技术分析猕猴桃酒香气特性的相关报道。

因此，本实验以中华猕猴桃（黄金果）、美味猕猴桃（徐香和海沃德）为原料酿造猕猴桃酒，采用SPMEGC-MS和电子鼻技术相结合的方法检测其挥发性风味成分，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）探索3 种猕猴桃酒香气特性的差异，从而为适宜酿酒猕猴桃品种选择、猕猴桃酒整体品质评价及其香气控制和提升提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猕猴桃原料购于陕西省杨凌农贸市场（徐香、海沃德和黄金果）；酿酒酵母WLP775为西北农林科技大学酿酒与生物技术实验室保存；2-辛醇（内标）、正构烷烃混合标品（C6～C25） 美国Sigma公司；果胶酶上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ISQ GC-MS联用仪 美国Thermo Fisher公司；手动SPME进样器、75 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）手动萃取头、HP-INNOWAX柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）美国Supelco公司；PEN3型便携式电子鼻 德国Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 猕猴桃酒的酿造[19]

本实验以3 个不同品种猕猴桃为原料，采用与生产相类似的工艺酿造猕猴桃酒。

1.3.1.1 酿造工艺流程

1.3.1.2 操作要点

选择成熟度好，无腐烂变质的猕猴桃；装罐前用SO2熏罐，并加入60 mg/L SO2；在果汁中添加60 mg/L果胶酶，室温酶解8 h，提高出汁率；按5%的量接入酵母种子液进行发酵，发酵温度22 ℃、发酵时间7 d，当可溶性固形物含量基本不变、还原糖含量低于4 g/L时终止发酵；倒罐时添加SO2以抑制发酵的进行和使原酒尽快澄清；陈酿在低温下进行。

1.3.2 SPME-GC-MS测定香气成分

1.3.2.1 SPME条件

取15 mL样品装入40 mL的萃取瓶中，加入5 g NaCl和40 μL内标2-辛醇（溶于乙醇，质量浓度为0.4 mg/mL），用聚四氟乙烯-硅胶隔垫加盖密封，40 ℃平衡15 min，然后将已老化（270 ℃，1 h）的萃取头插入样品瓶，顶空萃取30 min，搅拌速率300 r/min。

1.3.2.2 GC条件

HP-INNOWAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；程序升温：50 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至230 ℃，保持3 min；不分流进样；载气（He）流速1.0 mL/min；进样口温度230 ℃。

1.3.2.3 MS条件

电子电离源；电离电压70 eV；离子源温度240 ℃；传输线温度250 ℃；质量扫描范围m/z 45～450。

1.3.2.4 定性和定量

定性：未知化合物经计算机检索的同时与NIST Library和Wiley Library相匹配，选择匹配度较高的检索结果，并与文献中相关化合物的保留指数（retention index，RI）比对分析确定；定量：以2-辛醇为内标，用内标法进行半定量计算。

1.3.3 特征香气成分的确定

特征香气由气味活性值（odor activity value，OAV）确定，当OAV不小于1时即可被确定为特征香气物质。OAV是香气物质的浓度与其感觉阈值之比。

1.3.4 电子鼻检测

表1 PEN3电子鼻传感器阵列及其主要特性Table 1 Sensors used in PEN3 electronic nose and their main properties

PEN3型电子鼻传感器由10 种金属氧化物传导阵列构成，不同传感器性能描述如表1所示。准确量取10 mL猕猴桃酒样置于30 mL样品瓶中，密封室温平衡15 min，插入电子鼻探头吸取顶端空气，测定挥发性物质。电子鼻参数设置：检测时间60 s，预进样5 s，清洗时间300 s，进样流量300 mL/min，载气流速300 mL/min。测定时传感器响应值逐渐增大，第50秒后趋于平缓，取第51秒处信号作为传感器信号分析的时间点。每种酒样重复测定10 次。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0进行显著性分析，采用GraphPad Prism 6.0绘图。电子鼻所测数据用其自带的Winmuster软件进行PCA。

2 结果与分析

2.1 SPME-GC-MS测定不同猕猴桃酒中香气物质

表2 猕猴桃酒中香气物质的GC-MS鉴定结果Table 2 Aroma compounds in kiwifruit wines identi fied by GC-MS

续表2

如表2所示，猕猴桃酒中共检出63 种香气物质，包括醇类13 种、酯类28 种、酸类7 种、萜烯类7 种、醛酮类3 种、酚类4 种、呋喃类1 种，3 种酒中共有物质35 种。徐香酒、海沃德酒和黄金果酒中分别检出52、45 种和46 种，总质量浓度分别为81.56、43.92 mg/L和15.07 mg/L。

图1 猕猴桃酒中各类香气物质总量比较Fig. 1 Comparison of total contents of various volatile classes in kiwifruit wines

如图1所示，3 种猕猴桃酒中含量最高的前三类香气物质均依次为醇类、酯类和酸类，含量最低的均为醛酮类，这种香气特性与市售的同类商品基本一致。3 种酒中醇类和酯类总量差异显著，且均为徐香酒中最高，黄金果酒中最低；徐香酒和黄金果酒中酸类总量差异不显著，且海沃德酒中酸类总量显著高于这2 种酒。此外，海沃德酒和黄金果酒中酚类总量高于萜烯类总量，而徐香酒中萜烯类物质总量较高。

2.1.1 猕猴桃酒中醇类化合物分析

醇类化合物是酵母通过糖分解代谢或脱羧反应和氨基酸的脱氨基作用形成的代谢产物[23]，适宜浓度该类物质可衬托酯香，促进香气的协调性，是果酒中重要的香气物质。本实验中，徐香酒所含醇类化合物质量浓度最高（56.58 mg/L），其次是海沃德酒（21.23 mg/L），黄金果酒中最低（6.77 mg/L）。3 种猕猴桃酒中共检出13 种醇类物质，共有的8 种，分别为1-戊醇、正己醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、苯甲醇、苯乙醇、3-甲硫基丙醇和癸醇。3-甲硫基丙醇又称菠萝醇，存在于水果、啤酒、白酒、果酒和酱油中，浓度较低时有洋葱和肉汤的气味，3 种猕猴桃酒中该物质质量浓度在17.79 μg/L～1.40 mg/L间，均在报道果酒中的含量范围内（10.1 μg/L～1.47 mg/L）[24]。徐香酒中检出10 种醇类物质，海沃德检出11 种，黄金果酒检出10 种；此外，3 种酒中含量最高的均为苯乙醇。苯乙醇是莽草酸衍生物，有玫瑰花香和蔷薇香；异戊醇是杂醇油或高级醇的主要成分，有苹果白兰地香气和辛辣味[25]。3-辛醇和1-戊烯-3-醇仅在海沃德酒中检出，说明该猕猴桃酒玫瑰香味和橙似水果香气更加浓郁。

2.1.2 猕猴桃酒中酯类化合物分析

酯类主要来源于果实和乙醇发酵，具有水果香气，是对酒香气有很大影响的一类呈发酵香化合物[26]。在本研究中，徐香酒中酯类质量浓度（19.11 mg/L）显著高于海沃德酒（14.64 mg/L）和黄金果酒（3.95 mg/L），这与醇类含量趋势相一致。3 个猕猴桃酒样中共检出酯类28 种，共有的17 种，其中脂肪酸乙酯占50%，乙酸高级醇酯占25%，芳香酯和脂肪酸甲酯各占12.5%。徐香酒中共检出22 种酯类化合物，其中乙酸乙酯质量浓度最高（6.37 mg/L）；黄金果酒和海沃德酒中分别检出24 种和19 种，且质量浓度最高的均为乙酸异戊酯（0.77、5.93 mg/L）。徐香酒中4 种芳香酯（甲酸苯乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯）的质量浓度均显著高于黄金果酒和海沃德酒，说明该酒样有更加浓郁的玫瑰花香、苹果香和蜂蜜样香气。

2.1.3 猕猴桃酒中酸类化合物分析

脂肪酸类物质在浓度较低时呈奶油和奶酪香，浓度太高则会产生酸涩味和腐臭味[27]；其可与醇类物质发生反应，形成酯类，使酒体香气更加协调、平衡[28]。徐香酒、黄金果酒、海沃德酒中分别检出5、4 种和6 种酸类物质，共有的3 种，分别为己酸、辛酸和癸酸；此外，这3 种酒中含量最高的均为辛酸。辛酸通常呈油性霉味和腐臭味，但当其浓度较低时，具有令人愉悦的奶酪香和水果香。

2.1.4 猕猴桃酒中萜烯类化合物分析

萜烯类化合物一般以糖苷形式存在于果实中，果酒酿造过程中，在酸或酶水解作用下形成游离态具有挥发性的物质，从而赋予果酒水果香和花香，是果酒中重要的品种香气；此外，该类物质香气阈值较低，即使在较低浓度下对果酒香气也有较大贡献[20]。3 种猕猴桃酒中共检出7 种萜烯类物质，共有的2 种，分别为香茅醇和桉叶油醇。香茅醇可赋予果酒浓郁的玫瑰花香，而桉叶油醇具有薄荷香气和热带水果的甜香。徐香酒中检出7 种萜烯类物质，总量为1.01 mg/L，其中含量最高的为(-)-4-萜品醇；黄金果酒和海沃德酒中均检出3 种，含量最高的分别为桉叶油醇和4-萜烯醇。苏合香烯、α-松油醇和胡椒酮仅存在于徐香酒中。

2.1.5 猕猴桃酒中醛酮类化合物分析

醛酮类物质可通过醇氧化形成，可为果酒提供水果香，但这类化合物不稳定，会进一步氧化成羧酸，使其含量降低[29]。本实验酒样中仅检出苯甲醛一种醛类物质，该物质可赋予猕猴桃酒苦杏仁气味，且在徐香酒中含量最高。此外，检出2 种酮类物质，具体为甲基庚烯酮和仲辛酮，其中前者在3 个酒样中均有检出，而后者仅存在于徐香酒中。

2.1.6 猕猴桃酒中酚类和呋喃类化合物分析

苯酚类化合物浓度较高时可赋予果酒类似药的香气[30]。3 种猕猴桃酒中共检出4 种酚类物质，共有的3 种，分别为丁香酚、2,4-二叔丁基苯酚和对乙烯基愈创木酚；且对乙烯基愈创木酚为3 个酒样中含量最高的酚类物质。丁香酚在徐香酒中含量最高，因此该酒样具有浓郁的丁香花香；此外，呈康乃馨和焦糖香的异丁香酚仅存在于徐香酒中。仅检出2,3-二氢苯并呋喃一种呋喃类化合物。

2.2 猕猴桃酒特征香气物质比较分析

表3 猕猴桃酒特征香气成分OAV分析Table 3 OAV analysis of aroma characteristics of kiwifruit wines

OAV是评价挥发性物质对酒整体香气感官贡献率的常用方法。当OAV大于1时，该香气物质能被人感知；但OAV小于1的挥发性物质也不应被忽视，其对酒整体香气也起一定的促进和协调作用[31]。

本实验根据已报道香气物质的感觉阈值及其特征描述，结合GC-MS检测结果，共得到16 种特征香气物质。由表3可知，徐香酒、海沃德酒和黄金果酒中分别有14、12 种和8 种特征香气物质，3 种酒中共有的7 种，包括丁酸甲酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸、桉叶油醇、丁香酚和对乙烯基愈创木酚。陈红梅等[32]发现丁酸甲酯、乙酸异戊酯及正己酸乙酯也是野生猕猴桃酒的特征香气物质。3-甲硫基丙醇、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯和癸酸仅在徐香酒中OAV大于1，说明这4 种物质是徐香酒区别于其他2 种酒的特征香气物质；这与戚一曼等[33]的研究结果一致。苯乙醇、丁酸乙酯和癸酸乙酯在徐香和海沃德酒中的OAV大于1，即这2 种酒和黄金果酒相比较具有更浓郁的玫瑰香、蜂蜜香、水果香及脂肪味。4-萜烯醇仅在海沃德酒中OAV大于1，说明该酒有更浓郁的青草香和甜香。由此可知，3 种酒香气物质的独特性与辨识度从高到底依次为徐香酒、海沃德酒和黄金果酒。

2.3 电子鼻分析不同猕猴桃酒中香气物质

2.3.1 猕猴桃酒电子鼻传感器响应值的对比分析

图2 3 种猕猴桃酒的电子鼻雷达图Fig. 2 Electronic nose radar profiles of three kiwifruit wines

将徐香酒、海沃德酒和黄金果酒的电子鼻数据作雷达图，对比结果如图2所示。电子鼻每个传感器对3 种猕猴桃酒均有明显的响应，且响应值均不相同，其中传感器W5S、W1W、W2S和W1S的响应值显著高于其他传感器的，这与马婷等[34]对亚特猕猴桃果实香气特性的研究结论相一致；此外，秦美猕猴桃低温贮藏过程中，W5S和W1W的响应值也显著高于其他传感器的[35]。

徐香酒在W1W和W2S传感器上的响应值均显著高于海沃德酒和黄金果酒的，这2 个传感器分别对萜烯类和醇类物质敏感。W1C、W3C和W5C均对芳香类物质敏感，与其他7 个传感器相比，猕猴桃在这3 个传感器上的响应值均较小；且黄金果酒在W1C和W5C上的响应值高于其他2 种酒的。海沃德酒在W5S上的响应值低于徐香酒和黄金果酒的，但是在W2W上的响应值高于其他2 种酒。3 种猕猴桃酒在W1S、W3S和W6S传感器上的响应值均为徐香酒最高，海沃德酒次之，黄金果酒最低。由上述分析可知，3 种猕猴桃酒的香气特性有较大差异，且徐香酒中香气物质最丰富，特别是萜烯类和醇类，这与GC-MS检测结果基本一致。

2.3.2 电子鼻结合PCA区分不同猕猴桃酒

如图3A所示，PC1贡献率为72.53%，PC2贡献率为16.92%，总贡献率为89.45%，大于85%，说明不同猕猴桃酒之间风味相互独立，且这2 个主成分可代表样品挥发性风味的主要特征。每组样品测定数据均能成团，说明电子鼻数据稳定性和重复性较好。3 种不同猕猴桃酒样的香气成分区域无交叉，从PC1角度看，徐香酒和黄金果酒位于正向端，而海沃德酒位于负向端；从PC2角度看，海沃德酒和黄金果酒位于正向端，而徐香酒位于负向端。由上述分析可得，PCA法可将3 种不同猕猴桃酒的香气物质完全区分，且徐香酒和海沃德酒风味差别最明显。

图3 猕猴桃酒电子鼻PCA（A）和载荷分析（B）图Fig. 3 PCA (A) and loading analysis (B) of electronic nose sensor data of kiwifruit wines

由图3B可知，W1S和W2S对PC1贡献率最大，W5C对PC2贡献率最大；结合图3A可知，海沃德酒香气特性和其他2 种酒的差异主要体现在有机硫化物上，黄金果酒与其他2 种酒香气物质的差异主要体现在芳香类物质上，而徐香酒与其他2 种酒差异主要体现在醇类、萜烯类、氮氧化物和甲基类物质上。因此，通过对电子鼻数据的PCA，进一步验证了GC-MS分析的3 种猕猴桃酒香气特性的差异；此外可采用电子鼻技术对不同品种猕猴桃所酿造的猕猴桃酒进行区分。

3 结 论

结果表明猕猴桃酒具有较丰富的挥发性香气物质，且不同品种猕猴桃所酿造果酒香气特性有较大差异。采用SPME-GC-MS法对不同猕猴桃酒中香气物质进行全面检测分析，3 种猕猴桃酒中共检出63 种香气物质，其中醇类13 种、酯类28 种、酸类7 种、萜烯类7 种、醛酮类3 种、酚类4 种、呋喃类1 种。香气物质总量从高到低依次为徐香酒、海沃德酒和黄金果酒，且徐香酒中香气物质种类数最多。OAV法鉴定出丁酸甲酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸、桉叶油醇、丁香酚和对乙烯基愈创木酚为3 种猕猴桃酒共有特征香气物质。此外，电子鼻对猕猴桃酒香气物质有明显响应，利用PCA法可完全将徐香酒、黄金果酒和海沃德酒区分，且电子鼻与GC-MS测定结果基本一致，均表明徐香酒与海沃德酒风味差异最明显。因此，可利用GC-MS结合电子鼻技术对不同猕猴桃酒香气特性进行综合评价和区别，这将为猕猴桃酒酿造原料的选择及其香气品质的调控和提升提供理论依据。