香茅psbA-trnH序列鉴定及挥发油成分气质联用分析

吴双双，徐榕青，林文津，郑荣生，徐小妹，张亚敏，李丽莎，卢雪花

(1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350003；2. 福建省医学科学研究院、福建省医学测试重点实验室，福建 福州 350001；3. 南平市王台越王香业有限公司，福建 南平 353003)

香茅别名柠檬草[Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf]，禾本科香茅属芳香性植物，具有疏风解表，祛瘀通络，治感冒头痛、胃痛、泄泻、风湿痹痛、跌打损伤等药用价值，其对生长环境要求较低而在全国多地分布广泛，具有很高的开发价值。研究表明香茅挥发油中有多种有效成分，包括香茅醇、香叶醇、柠檬醛及丁香酚等。其地上部分的挥发油提取物具有胃保护和治愈胃溃疡作用[1]，同时大量报道显示香茅提取物中含有的香茅醇、香茅醛、柠檬醛等物质具有抗氧化作用[2]、预防或治疗神经退行性疾病及炎症[3]、抗病毒作用[4]，近期研究证明其具有抗肿瘤作用，临床上使用其主要成分柠檬醛治疗前列腺癌[5]。香茅在食品工业、农业等领域也有很重要的应用价值，对香茅进行准确的物种鉴定对其在各领域应用有重要意义。

DNA条形码中药种属鉴定是一种能够利用较短DNA片段对药材进行种属鉴定的分析手段，鉴定系统已经较为完善[6]，弥补了传统植物鉴定方法的缺陷，对中药传承和发展有着重要的作用。本研究通过DNA条形码序列测评，对植物香茅进行了种属鉴定。确定种属之后选择了气质联用的手段对香茅挥发油进行了定性定量分析，气质联用是一种研究中药挥发性成分的有效方法，具有高效、低检测限、准确度高等优良特性[7]，香茅的定量定性分析可以较好的确定香茅品质优劣，以期为香茅在重要市场上的准确应用提供有效的参考。

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器

气质联用仪(7890B-5977A，美国Agilent公司)；PCR仪(T100，美国Bio-Rad公司)；超微量紫外分光光度计(DUO型号，Bio-Drop公司)；电泳仪(DYY-6C，北京市六一仪器厂)。

1.2 实验药材与试剂

香茅采自福建省南平市延平区，经福建省医学科学研究院副研究员林文津老师鉴定为禾本科香茅属香茅(拉丁学名：Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf )；2 × Easy Taq PCR Super Mix(北京全式金生物技术有限公司，AS111-14)；DL1000 DNA Marker(合肥博美生物科技有限公司，20180413)；氯仿、异戊醇、异丙醇、β-巯基乙醇、无水乙醚及无水硫酸钠均为国产分析纯。PCR扩增引物信息：psbAF：5'-GT TATGCATGAACGTAATGCTC-3；trnHR: 5'-CGCG CATGGTGGATTCACAATCC-3'，由上海生工合成。

2 方法

2.1 待测液制备

取香茅新鲜叶片0.2 g，无水乙醇擦洗香茅叶片表面，采用CTAB法提取植物DNA[8]，在4℃下保存备用。

称取一定量的香茅粉末，置于1500 ml的圆底烧瓶中，加入4倍量的水，搅拌使粉末被充分浸润，24 h后，加入6倍水，加热至微沸后保持180 min[9]，停止加热，保持冷凝状态至装置冷却完全，在挥发油提取器中读取所提挥发油的体积，收集油水混合物，用10 ml乙醚萃取3次，收集合并上层清夜，加无水硫酸钠除水后过滤，置于室温下挥至2 ml，4℃下储存备用。

2.2 PCR扩增与测序

采用超微量紫外分光光度计对样品DNA的浓度和纯度进行检测并记录。植物类中药材及其基原物种选择psbA-trnH序列作为扩增序列，利用中药材DNA条形码鉴定系统中的数据库搜索药材香茅得到香茅psbA-trnH序列信息，确定为PCR扩增目的基因[9]。从中药材DNA条形码鉴定系统查询到植物通用的DNA条形码片段(psbA-trnH)序列扩增通用引物对香茅DNA进行PCR扩增[9]。

PCR反应体系：DNA模版2 μL；上游引物2 μL；下游引物2 μL；2×Taq PCR Mix 25 μL；ddH2O 19 μL；total 50 μL。PCR反应程序：psbA-trnH：预变性温度94℃，10 min；变性温度94℃，30 s；退火温度56℃，30 s延伸温度72℃，45 s；最终延伸温度72℃，10 min，35个循环。

使用测序仪将扩增成功的PCR产物进行双向测序。测序峰图采用序列拼接软件进行校对拼接，得到香茅的DNA序列。使用BLAST序列对比软件及Evoliew法构建距离树法对测得的DNA序列与数据库中香茅DNA进行比对验证。

2.3 气质联用分析挥发油成分

气相色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱(30 m × 250 μm × 0.25 μm)，程序升温(初始温度为50℃，保持3 min，以5℃·min-1上升至250℃，保持7 min)，载气为氦气，采用恒流模式，柱流量为0.8 ml·min-1，平均线速度为32.597 cm·s-1，进样量为0.4 μL，进样口温度250℃，分流比1∶40。

质谱条件：采用EI电离方式，EU电压1200 V，电子能量70 eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，扫描范围m/z 50-550。

按上述实验条件，对供试品溶液进行气质分析，得到气质总离子流图如图1。经质谱工作站Wiley275、CAS、NIST11标准质谱图数据库对化合物进行检索，并结合图谱分析，鉴定样品组成。

图1 香茅挥发油气质总离子流图Fig. 1 Total ion flow of citronella essential oil

3 实验结果

3.1 香茅的DNA测序结果

DNA双向测序得到香茅DNA条形码的序列为：CTCTAGACCTAGCTGCTCTTGAGTTCCATCTCTT

AATGGATAAGGTTTTCTCCTAAACATATAGGAATTT

TTGAAGGAAGGAAAGCCGGAAATACCCAATATCTT

GTTCCAACAGGATATTGGGTATTTCTTTGTTTATTCT

GAATCTTTCTATTCTGAATTCAATTAACGACGAGAT

TTAGTATCCTTTCTTGTACTTTCATAACTCGTGAAAT

GCCGAGTAGGCACGAATTCCCCCAATTTGCGACCT

ACCATAGGATTTGTTATGTAAATAGGTATATGTTCT

TTTCCATTATGAATCGCGATTGTATGGCCAACCATT

GCGGGTAGAATGCTAGATGCCCGGGACCACGTTAC

TATTATTTCTTTCTCCTCCTTCATATTGACCTTTTCGA

TTTTTGCCAATAAATGACGAGCTACAAAAGGATTCG

TTTTTTTTCGTGTCACAGCTGATTACTCCTTTTTTTC

ATTTTAAAGAGTGGCATCCTATGTCCACTATCTCGA

TCGAGGTATGGAGGTCAGAATAAATAGAATAATAA

TGAATGGAAAAAAGAGAAAATCCTTTAGCTGGATA

AGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGTGG

ATTGTGAATCCCCAATGCGCGA(631bp)

3.2 DNA条形码候选序列鉴定效率评价

3.2.1 BLAST法

去除样本条形码序列中头尾不稳定序列，并与基因数据库中所有序列进行碱基比对,结果显示：

>Cymbopogon_citratus_GQ435011

Length=535 Score=1088 bits (535)，Expect=0.0 Identities=589/589 (100%)

Strand = Plus / Plus

按碱基差异进行排名，排名第一的物种与样本物种相同成功鉴定。

3.2.2 Evoliew法构建距离树法：

将样本的条形码序列与条形码数据库中所有序列进行碱基比对，按碱基差异进行排名，对排名靠前的物种序列及样本序列导入软件中绘制进化树。

3.3 GC-MS分析结果

对气质联用结果进行定性定量数据分析，按面积归一化法计算各峰在挥发油中的相对百分含量。成分相对含量大于2.5%且匹配度高于85%的成分如表1所示。

通过对图1香茅挥发油总离子流图的分析，得到挥发油组分如表1所示，从福建香茅中一共分离出43个组分，检索符合筛选条件的成分共有9种，已鉴定的主要成分为单萜及其含氧衍生物。其中相对含量较大的有香茅醇(12.76%)、香叶醇(14.54%)、柠檬醛(5.33%)、榄香醇(12.57%)。

4 讨论

香茅属植物形态相似，传统鉴别比较依赖专业人员，使用混乱频率较高，影响了香茅的质量安全和临床疗效。通过GenBank数据库序列对比最终得到香茅及其混伪品序列104种，其近亲属序列及生物形态与之十分相近，鉴定人员利用传统经验判断种属的准确度难以跟上现实需要，而使用DNA条形码序列通用引物进行扩增测序可以有效增加种属鉴定可靠性。研究过程发现psbA-trnH通用扩增引物与ITS2通用扩增引物对样本DNA的扩增效果有较大不同，ITS2引物扩增较难，对实验结果的准确性影响较差，所以选择psbA-trnH扩增引物进行扩增。所测序列应用BLAST数据库自动对比分析后的结果显示，所测样品与数据库中所记载的基因序列吻合度为96%，种属相似度排名62位，通过分析鉴定结果可以看出，扩增序列与基因库中香茅序列中间段完全吻合，前段序列出现偏差，可以认为是前段序列不稳定所致，吻合度排名靠前的物种与样品序列在序列中间段存在偏差。由此可见，psbA-trnH序列可有效鉴定香茅及其混伪品，保障香茅的质量安全和临床疗效，并为保证药材在市场上的安全流通和质量监管提供参考。

图2 香茅属相近种属距离树Fig. 2 Distance trees of similar genera of Citronella

序号Number保留时间(min)Retention time化合物名称Compound name相对含量(%)Relative content匹配度(%)Matching degreeCAS号CAS Number114.0513,7-Dimethyl-6-octenal[香茅醛]2.9389000106-23-0216.9163,7-Dimethyl-6-octen-1-ol[香茅醇]12.7693000106-22-9318.182(2E)-3,7-Dimethyl-2,6-octadien-1-ol[香叶醇]14.5490000106-24-1418.2263,7-Dimethyl-2,6-octadienal[柠檬醛]5.5396005392-40-5521.0264-Allyl-2-methoxyphenol[丁香酚]3.2398000097-53-0626.128d-Cadinene[d-杜松]3.6893000483-76-1727.114Cyclohexanemethanol[榄香醇]12.5791000639-99-6829.276Eudesm-4-en-11-ol (8CI)[桉叶油醇]5.2499001209-71-8929.544T-Cadinol[T-杜松醇]4.7691005937-11-1

注：在挥发油测量器中读取挥发油的体积为1.08 ml。

香茅及香茅挥发油具有较高的药用、食用价值。本实验采用水蒸气蒸馏法提取香茅挥发油，挥发油得率为1.07%，多为低沸点挥发油成分。香茅挥发油成分繁多，极个别组分含量较高，且各成分的分子结构、相对含量较接近，可以通过降低样品浓度、加大分流比、减慢程序升温的速度等方法实现较好的分离。

通过气质联用分析香茅挥发油的主要成分为香茅醛、香叶醇、香茅醇、柠檬醛、丁香醇，属于典型的爪哇型香茅[10]。其中香茅醛可作为潜在麻醉剂[11]，香茅醇具有减少糖尿病大鼠中的肝脏组织学损伤并逆转胰腺中胰岛的组织学损伤作用[12]、抗白内障作用[13]及解痉作用[14]，丁香酚具有明显的抗菌作用，可以减缓大肠杆菌耐药性[15]，柠檬醛对于子宫平滑肌的松弛有一定的效果[16]。通过对香茅挥发油成分的分析，为香茅后续的质量控制、药理研究及合理利用提供科学依据。