四川省稻城县3个藏香猪猪场腹泻样本4种病毒的检测

张 敏，杨丹娇，刘怡雯，吴建平，蓝 岚，叶忠明，何宗伟

（1.甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所，四川 甘孜藏族自治州 626000；2.稻城县农牧科技和供销合作局，四川 甘孜藏族自治州 627750）

在养猪业中腹泻是一种常见、多发对养猪业危害较为严重的影响养猪业发展的重要原因之一，能引起不同年龄、品种的猪发病，并能使患病猪死亡的病毒性疫病之一。近些年来腹泻所造成的猪死亡的数量逐渐上升，根据资料显示，从2010 年起由病毒造成的腹泻在我国多个省份都有暴发，仅在南方10省就导致100 万头以上仔猪死亡[1]。其中仔猪腹泻最为严重，导致仔猪腹泻的原因复杂，细菌感染、饲养管理、霉变饲料和环境因素等都能引起仔猪腹泻，但最为严重的是由病毒感染所引起的腹泻，所带来的损失也是最大，是影响养猪业发展的重要因素之一。其中猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea virus, PEDV）、猪δ 冠状病毒（Porcine Delta Corona virus, PDCoV）、传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV）和猪A 群轮状病毒（Porcine Group A Rotavirus, GARV）是造成猪腹泻最主要的4 种病毒。PEDV、PDCoV、TGEV 属于冠状病毒科、冠状病毒属，GARV 是呼肠孤病毒科轮状病毒属，而且4 种病毒的临床症状以及病理变化过程都十分相似，都以呕吐、水样腹泻和脱水等症状为主。会使饲料报酬下降，无形中使猪场的饲养成本增加了许多，并且还能让猪的抵抗力下降，使其他疾病更容易发生，而且在康复以后也可能会成为僵猪，是在世界各养猪场广泛流行的疾病之一，该病有一定的季节性，多发生于冬末春初的寒冷季节。

藏香猪作为稻城县重要的养殖品种之一，是当地人民重要的经济来源，但是由于饲养管理、基础设施等多种因素导致各种疫病和传染病发生率极高，其中仔猪腹泻尤为严重，是造成猪场经济损失的重要因素之一，但并没有对该地区仔猪腹泻情况的报道和调查，流行病学资料和猪的感染情况基本属于空白，但当地猪场时有因为仔猪腹泻导致的死亡，给猪场带来了较大的经济损失，制约了当地经济和养殖业的发展，所以试验采用RT-PCR 方法对稻城县3 个发生腹泻的猪场采集的共50 份腹泻样本，进行4 种腹泻病毒的检测，旨在查清3 个猪场腹泻的病因，为猪场的有效治疗和防控腹泻病毒提供参考，减少因腹泻带来的经济损失。

1 材料与方法

1.1 临床样本

试验从稻城县3 个发生腹泻的猪场共采集了50 份样本，其中在2018 年1 月木拉乡猪场采得25份仔猪腹泻样本，该猪场仔猪存栏750 头，发病60头，无死亡；2018 年2 月在傍河乡猪场采得10 份样本，该猪场仔猪存栏200 头，发病18 头，无死亡；2018 年2 月在金珠镇猪场采得15 份腹泻样本，该猪场仔猪存栏70 头，发病26 头，无死亡。

1.2 主要仪器和试剂

高速离心机（5801，Eppendorf 公司），凝胶成像仪（Universal HoodⅡ, BIO- RAD 公司），电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司），PCR 仪（美国Bio-Rad 公司），异丙醇溶液、75%冰乙醇、DPEC 水、RNA反转录试剂盒、DNA Marker TRIZOL 试剂、氯仿溶液。

1.3 RNA 的提取和cDNA 的合成

根据Trizol 说明书提取粪便样品的总RNA。按照Super Script TM III Reverse Transcriptase（TAKARA,CHN）使用说明书将提取的病毒总RNA 反转录成cDNA；-20 ℃保存。

1.4 RT-PCR 检测4 种病毒

PEDV、TGEV、GARV 的检测方法参考曹恭貌等四川部分猪场PEDV、TGEV、GARV 和PKV 感染状况调查中报道的方法[2]，PDCoV 的检测方法参考彭艳伶等在凉山地区猪腹泻样本中PEDV、PDCoV 和GARV 感染检测中报道的方法[3]，所有引物均由宝生物工程（大连）有限公司合成，引物具体信息见表1。

表1 检测4 种病毒的引物信息

反应体系和反应条件：用4 种病毒的cDNA 模板与其对应的引物进行扩增。体系为10 体系，上下引物各0.5 μL、ddH2O 3 μL、cDNA 模板1 μL、酶5 μL。

扩增条件：PCR 扩增条件为：95 ℃5 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃55 s，35 个循环，72 ℃8 min，4 °C 保存。

反应结束后，取产物5 μL 在含核酸染料的凝胶板上进行点样，并点等体积的DNA MarkerⅡ作对照，在电泳仪中电泳20～40 min，电泳完成后再凝胶成像仪中观察是否有条带以及条带出现情况，进行结果判定。将检测结果为阳性的核酸样本送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序比对分析。

2 试验结果

试验结果表明，从3 个猪场50 份腹泻样本中PEDV 检出阳性样本30 份，样本总阳性率为60%，场阳性率为100%，各个猪场PEDV 阳性情况见表2。PDCoV、TGEV、GARV 3 种病毒未检出。部分PEDV的电泳图见图1。

表2 3 个猪场PEDV 的检出率

图1 PEDV RT-PCR 扩增部分结果

因此可知，3 个猪场都感染了PEDV 且感染率极高，是3 个猪场腹泻的主要病原。

3 讨论

稻城县仔猪腹泻严重，但发病原因不清楚。本试验对3 个猪场的腹泻样本进行了检测，检测结果表明，PEDV 的检出率十分高，确定PEDV 是腹泻的主要病因，因此加强对病毒性腹泻的防控是提高猪场经济收入的有效措施。近年来藏香猪的养殖发展十分迅速，PEDV 带来的损失也较为严重，该研究进一步为仔猪腹泻的防控提供参考。虽然其余3 种病毒未检出，但猪腹泻的新病原PDCoV 也逐渐受到关注。已有研究证实，从临床样本中分离的PDCoV 可引起5 日龄新生仔猪剧烈腹泻，产生与PEDV、PoRV（轮状病毒）等常见腹泻病原极为相似的临床症状及病理组织学变化，在防治PEDV 时也应该重视其余3 种病毒[4]，虽然没有检出但不排除健康猪带毒的情况，以防止3 种病毒的突发带来的经济损失[5]。

关于藏香猪PEDV 的流行病学资料较少，但试验结果与2013—2014 年四川省9 个地区的代表样品，PEDV 的阳性率为86.67%相近[6]，同时也符合四川省以PEDV 阳性率最高的调查结果[2]。2016 年1—6 月，对我国26 个省份收集到的896 份血清样品进行PEDV、PoRV 和TGEV 抗体检测，结果显示PEDV 和TGEV 抗体阳性率分别为62.3%、23.0%[7]。薛瑞雪等调查显示，山东省部分地区猪场PEDV 和TGEV 感染率分别为34.96%、2.21%[6]。大量资料表明，PEDV 是造成我国猪场仔猪腹泻的主要原因[8]，因此对藏香猪腹泻调查以及加强对仔猪腹泻防控十分必要。

稻城仔猪腹泻情况严重，仔猪腹泻病因复杂，病毒感染是最常见的因素[9]，因此试验同时对4 种病毒进行了检测，最终只检测出PEDV，表明PEDV 是造成仔猪腹泻的主要原因，这为提高猪场经济收入、仔猪腹泻的防控提供参考[10]。