不同猪种背最长肌中miR-23a、miR-151、miR-299、miR-199a 和miR-497 的差异表达研究

王 言，顾以韧，杨雪梅，梁 艳，杨跃奎，陶 璇，钟志君，陈晓辉，曾 凯，何志平，吕学斌（四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066）

微RNA（microRNA，miRNA）是一类非编码的内源性小分子RNA，在生物中普遍存在。大小只有19～24 个核苷酸，它们广泛存在于多种真核生物体中，通过与靶mRNA 的3'UTR（非编码区域）互补结合，可降解该mRNA 或抑制其翻译，其在基因表达调控、生物个体发育、代谢、疾病发生和免疫调控等生理过程中均发挥着重要的作用[1-3]。miR-23a 以ZNF423 为靶基因，抑制牛胎儿骨骼肌来源的前体脂肪细胞分化过程[4]。miR-151-3p 通过ATP2a2 参与调控慢肌的发生发育过程[5]。Ana等研究发现miR-199a 能促进成年小鼠心肌细胞重新进入细胞周期，并且促进新生小鼠和成年小鼠心肌细胞的增殖[6]。miR-299 是调控生肌调节因子Myf6 的候选miRNA，可正向调控C2C12 成肌细胞分化[7]。miR-497 参与心肌细胞的早期发育[8]，miR-497 表达量的提高是成肌分化的前提条件，并且miR-497 可能通过HMGA1-Id 通路调控成肌分化[9]。

猪是畜牧生产中重要的家畜，它作为人类最重要的蛋白质来源之一，具有重要的经济价值。随着生活水平的提高，消费者对肉质好、营养健康的优质猪肉产品的需求量剧增。然而过去的几十年间，对猪的遗传改良主要集中在一味提高生长速度和增加瘦肉率等生长和胴体性状方面，这也导致了猪肉品质的急剧下降[10-11]，故在生产生长速度快、瘦肉率高的猪同时，兼顾到猪肉品质好已成为目前猪育种界的研究热点。藏猪、雅南猪、内江猪和大约克夏猪在胴体和猪肉品质上呈现巨大表型差异，使其成为肉质相关研究的理想试验材料。鉴于上述miRNA 与调控肌肉与脂肪细胞分化过程有密切的关系，本研究以经过高度人工选育的引进猪种大约克夏猪、选育程度较低的地方猪种（雅南猪、内江猪）以及四川省特有的高原型品种藏猪为研究对象，采用Q-PCR 技术对其背最长肌组织中miR-23a、miR-151、miR-299、miR-199a 和miR-497 的表达与肉质性状的差异进行了研究。该研究为阐明不同猪种肉质差异形成的分子机制提供基础数据，将为优质风味猪育种提供重要的科学依据。

1 试验时间、地点与试验材料

试验在四川省畜牧科学研究院养猪所科研基地进行。选择健康状况良好、日龄相近的藏猪、雅南猪、内江猪和大约克夏猪各3 头，于2015 年12 月开始组建群体，分圈饲养，并在相同条件下饲喂，试验期间所有猪自由采食饮水。所有试验猪达9 月龄时进行屠宰，宰前空腹24 h，自由饮水。屠宰后迅速采集左胴体倒数第3、4 肋骨间背最长肌组织样本，用于后续的肉质表型指标测定和RNA 提取。

2 试验方法

2.1 肉质性状表型指标的测定

2.1.1 肌内脂肪含量的测定 利用全自动索氏抽提仪（BUCHI 公司）测定猪背最长肌中肌内脂肪的含量。样品处理和试验方法按照《肉与肉制品游离脂肪含量测定》（GB/T 9695.1—2008）进行操作。

2.1.2 肌纤维面积的测定 利用冰冻切片法和HE染色法制作背最长肌组织样品的冰冻切片，通过显微图像分析软件计算样品的肌纤维直径（面积）。

2.1.3 硫胺素含量的测定 样本处理和试验方法参照国家标准《食品中硫胺素（维生素B1）的测定》（GB/T 5009.84—2003）。

2.1.4 眼肌面积和瘦肉率的测定 测量左胴体倒数第3、4 肋间眼肌的宽、高，按照宽×高×0.7 计算眼肌面积。按照《猪胴体性状测定技术规范》（NY/T 825—2004）方法操作并计算瘦肉率。

2.2 qRT-PCR 检测

2.2.1 肌肉组织中总RNA 的提取 组织RNA 抽提使用Qiagen 公司的miRNeasy Mini Kit 试剂盒，RNA抽提过程严格按照试剂盒说明书进行。为保证RNA的质量，抽提得到的RNA 采用琼脂糖甲醛变性凝胶电泳和生物分析仪Agilent 2100 进行质量检测合格后，方可分别用于后续的荧光定量试验。

2.2.2 qRT-PCR 的操作步骤 采用反转录试剂盒根据操作说明书将RNA 转录成cDNA，在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad 公司生产）上进行荧光定量检测。反应体系（20 μL）：Sso－Fast EvaGreen 混合液10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物1 μL，RNA－free water（Ambion, USA）7 μL。5S、18S 和U6 作为miRNA 定量的内参基因，引物信息见表1。所有目的miRNA 定量结果均通过熔解曲线分析验证PCR 产物的特异性，确保产物无引物二聚体，每个样本重复3 次，每次检测含3 个阴性对照。采用2－ΔΔCt法计算目的miRNA 的相对表达量。

表1 引物信息

2.3 数据的统计分析

采用SPSS 软件对miRNA 相对表达量和肉质表型指标进行Duncan 分析其差异显著性，数据用平均数±标准差表示；采用Sigmaplot 12.0 中的Pearson Correlation 程序分析miRNA 相对表达量和表型指标的相关性。

3 结果与分析

3.1 相关肉质指标含量

由表2 可知，在4 个猪种中，藏猪和内江猪的肌内脂肪含量最高（4.91%），其次为雅南猪（3.87%），约克夏猪最低（2.04%），3 个地方猪种的肌内脂肪含量显著高于外种猪（P＜0.05）；藏猪肌纤维面积最小（3 712.86 μm2），显著或极显著小于其他3个猪种（P＜0.05），约克夏猪肌纤维面积最大（6 703.31 μm2），极显著大于藏猪和内江猪（P＜0.01），显著大于雅南猪（P＜0.05）；3 个地方猪种的眼肌面积在14～22 cm2之间，藏猪、雅南猪和内江猪的眼肌面积均极显著小于约克夏猪；3 个地方猪之间瘦肉率差异不显著，约克夏猪瘦肉率最高（63.84%），极显著高于3 个地方猪（P＜0.01）；雅南猪的硫胺素含量最高（2.79 μg/g），显著高于其他3 个猪种（P＜0.05），其次是藏猪（1.94 μg/g），内江猪和约克夏猪最低（1.11 μg/g），显著低于雅南猪和藏猪（P＜0.05）。

3.2 5 种miRNA 在不同猪种中的表达水平

采用Q-PCR 的方法检测了5 种miRNA 在猪背最长肌中的相对表达量，结果见表3。由表3 可知，miR-23a 在藏猪中的相对表达量高于其他3 个猪种，但差异不显著（P＞0.05）；miR-151 在藏猪中相对表达量最高，显著高于雅南猪和大约克夏猪（P＜0.05），雅南猪的miR-151 相对表达量显著高于约克夏猪（P＜0.05）；miR-199a 在约克夏猪中相对表达量最高，显著高于其他3 个猪种（P＜0.05）；miR-299 在约克夏猪中相对表达量最高，在藏猪中相对表达量最低，约克夏猪的miR-299 相对表达量显著高于藏猪和内江猪（P＜0.05），雅南猪的miR-299 相对表达量显著高于藏猪（P＜0.05）；miR-497 在约克夏猪中相对表达量最高，在内江猪中最低，约克夏猪中的miR-497 表达水平显著高于藏猪和内江猪（P＜0.05），藏猪和雅南猪中的miR-497 表达水平显著高于内江猪（P＜0.05）。

表3 5 种miRNA 在不同猪种中的表达水平

3.3 5 种miRNA 的相对表达水平与肉质相关指标含量的相关性

采用Sigmaplot 12.0 分析了肉质形状相关指标和基因表达量的相关性。由表4 可知，miR-23a 和miR-151 在猪背最长肌中表达水平与肌内脂肪含量和硫胺素呈正相关，与肌纤维面积、眼肌面积、瘦肉率呈负相关，其中miR-151 在背最长肌中的表达水平与肌内脂肪含量、肌纤维面积、眼肌面积和瘦肉率呈极显著相关性（P＜0.01）；miR-199a、miR-299 和miR-497 在猪背最长肌中的表达水平与肌内脂肪和硫胺素呈负相关，与肌纤维面积、眼肌面积、瘦肉率呈正相关，其中miR-199a 的表达水平与瘦肉率呈显著正相关（P＜0.05），miR-299 的表达水平与肌内脂肪含量呈显著负相关（P＜0.05），与肌纤维面积呈显著正相关（P＜0.05），miR-497 的表达水平与肌内脂肪含量呈显著负相关（P＜0.05），与瘦肉率呈显著正相关（P＜0.05）。

表4 5 种miRNA 的相对表达水平与肉质相关指标含量的相关性

4 讨论

猪肉风味品质的形成是涉及多基因、多途径和多阶段的复杂生理生化过程[12]。肌内脂肪含量越高，则肉的多汁性越好，所以肌内脂肪含量是猪肉口感的决定性因素之一；本研究中的3 个地方猪种的肌内脂肪含量（IMF）显著高于大约克夏猪，肉质口感更好。肌纤维直径越细，肉质就越细嫩；本研究中3个地方猪种的肌纤维面积都小于约克夏猪，所以肉质也较为细嫩。硫胺素是一种非常重要的风味前体物质，其热降解是食品加工过程中风味形成的主要途径之一；本研究中藏猪和雅南猪肌肉中的硫胺素含量显著高于内江猪和约克夏猪，肉质风味更好。胴体瘦肉率是评价胴体品质的主要指标，与眼肌面积呈极显著正相关，与肌内脂肪含量呈负相关，胴体瘦肉率过高会降低猪肉品质。本研究中藏猪、雅南猪、内江猪是四川省主要地方猪种资源，以耐粗饲，肉质优良，肌肉颜色鲜红、系水力强、细嫩多汁、富含肌内脂肪而著称，但其生长速度慢，瘦肉率在43%～48%之间，饲料转化率低，属选育程度较低的猪种；而从国外引进的大约克夏猪以高生长速度、高瘦肉率（63.84%）而著称，但其肉质相对较差，属典型经过高度选育的瘦肉型猪种。综上所述，3 个地方猪种相对于大约克夏猪，均属于肉质优良猪种，其肉质口感多汁细腻、风味较好，但瘦肉率较低，可作为优质风味猪的育种素材。

miRNA 对猪肌肉发育有着重要的调节作用。猪miR-23a 可靶向作用于Smad3 基因[13]，Smad3 可通过干扰MyoD 的活性和表达来调节Myostatin 的信号通路，从而抑制骨骼肌卫星细胞的分化[14]。miR-151在成肌细胞发育过程中的增殖阶段表达量增加，而在分化阶段表达量降低[5]。研究表明miR-199a 在肌肉发育过程中起重要作用[15]，在miR-199a/miR-214基因簇被敲除后背最长肌发育受到影响[16]。Yap 是miR-299 的潜在靶基因，Yap 是hippo 通路的成员，在C2C12 细胞的分化、肌卫星细胞命运的决定、肌肉纤维类型、肌肉萎缩等过程中有重要的作用[17-19]。miR-195/497 表达量的改变在小鼠模型和成肌细胞中影响Myogenin 的表达量，而钟嘉胜[9]研究指出Myogenin 具有增加胴体瘦肉率和眼肌面积，减低皮脂含量，提高腿臀比例，增加胴体长度等提高胴体肉品质的效应，另外Myogenin 同样影响着肉质的劣变。本研究中miRNA 相对表达量的结果显示，miR-23a、miR-151 在3 个脂肪型猪种中的表达量均高于瘦肉型猪种大约克夏猪，而miR-199a、miR-299 和miR-497 在大约克夏猪中的相对表达量高于在3 个脂肪型猪种中的相对表达量；相关性分析结果显示，miR-23a、miR-151 与肌内脂肪含量和硫胺素含量呈正相关，与肌纤维面积、眼肌面积和瘦肉率呈负相关，而miR-199a、miR-299 和miR-497 与肌内脂肪含量和硫胺素含量均呈负相关，与肌纤维面积、眼肌面积和瘦肉率呈正相关。这表明miR-23a、miR-151对猪肉品质具有正向调控作用，对猪胴体性能具负向调控作用；miR-199a、miR-299 和miR-497 对猪肉品质具有负向调控作用，对猪胴体性能具正向调控作用。

这5 种miRNA 与猪肌肉生长和脂肪沉积密切相关，本研究结果可为阐明猪肉品质形成的分子机理提供基础数据，也为通过调控其表达水平从而改善猪肉质和提高猪胴体性能提供了可能。