miRNAs筛选与HPV病毒检测应用于宫颈癌筛查的进展

郭 萍

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤之一，其高危人群多为有多个性伴侣、性生活过早、多孕多产、人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染、免疫功能低下、有宫颈病变史的女性。随着广泛开展宫颈癌筛查管理，宫颈癌的死亡率逐步降低。《美国预防服务工作组宫颈癌筛查指南》显示，死亡率由2000年每百万人2.8人，下降至2015年每百万人2.3人[1]。宫颈癌筛查的推广可及时发现早期病变，及时干预，进而阻断宫颈癌的进展。microRNAs(miRNAs)作为与宫颈癌相关的生物标志物，与HPV检测联合应用于高危人群的检测，在宫颈癌早期筛查和早期治疗中可能发挥着重要作用。本文就miRNAs与癌症的关系、miRNAs水平与宫颈癌发生与发展、miRNAs与HPV的联合筛查等方面的研究进展进行综述。

1 宫颈癌筛查概述

1.1宫颈阴道镜检查 可采用醋酸着色肉眼观察(visual inspection with acetic acid，VIA)或碘着色肉眼观察(visual inspection with Lugol’s iodine，VILI)，暴露宫颈，使用较大的棉球将醋酸溶液或碘液均匀地涂于宫颈表面，通过观察着色情况，对病变区域进行筛查。醋酸试验时宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)呈现白色，碘试验时CIN区不着色。Arbyn等[2]研究发现，醋酸、碘试验对CIN Ⅱ级筛检的灵敏度为79%，特异度为85%；对CIN Ⅲ级筛检的灵敏度为83%，特异度为84%。碘试验灵敏度高于醋酸试验灵敏度约10%，两种测试方法特异度无明显区别。

1.2宫颈细胞学检查 常用方法为巴氏细胞学和薄层液基细胞学检测法(thinprep cytologic test，TCT)。巴氏涂片法是使用阴道窥器扩张阴道内壁，暴露宫颈口，使用木质刮板刷出部分宫颈脱落细胞，直接涂到玻片上，通过显微镜观察是否存在病变。王晓林[3]对120例宫颈病变筛查患者进行分析，发现宫颈巴氏涂片法的灵敏度为83%，特异度为47%。TCT检测法使用专用的毛刷提取宫颈脱落细胞，置入固定液中保存，经过离心、制片、染色等步骤，对提取样本进行检查。低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)等同于病理活检报告中CIN Ⅰ级，高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)等同于CIN Ⅱ级、CIN Ⅲ级。TCT检测技术对临床诊断宫颈癌的灵敏度为94%，特异度为71%。

1.3宫颈癌基因检测 HPV检测，在宫颈口处使用取样刷采取足够的样本，并置入专用的固定液中，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法，检测宫颈癌病毒DNA。PCR法对宫颈癌筛检灵敏度为89%，特异度为48%，灵敏度较高，但由于HPV一过性感染的发病率较高，限制了其特异性[4]。

随着医学技术的不断发展和完善，宫颈癌的筛检率逐渐提高，但这些检测方式有各自的局限性。细胞学检测对CIN的检测敏感性较低，存在漏诊的情况。大多数HPV感染是短暂的，很少有细胞能持续感染，然而，HPV的持续感染不足以形成癌症，因为宫颈上皮细胞必须积累其他遗传和表观遗传变化，才能完全转为恶性肿瘤。致癌基因的扩增或激活突变，以及肿瘤抑制基因的失活突变，都是导致宫颈癌的常见因素。

2 miRNAs与癌症

miRNAs是长度为19～25个核苷酸(nucleotide，nt)的非编码RNA，在基因表达调控方面发挥重要作用[5]。目前，数据库中大约记录了2500个人类miRNAs，miRBase(www.mirbase.org)和特异性miRNAs已被描述为致癌基因或肿瘤抑制因子。miRNAs是已发现的宫颈癌相关的标志物之一。miRNAs的异常表达与HPV感染之间有重要关系[5]。

miRNAs作为宫颈癌及其前期病变的生物标志物，不仅需要从宫颈癌患者中提取标本，还需要从健康女性中选择合适的标本。应避免采用不适当的侵入性标本采集方法。miRNAs不仅在组织中过度表达，还会分泌到体液中，如血清、尿液、精液和阴道液中。由于膀胱肿瘤与尿液直接接触，尿液是诊断膀胱肿瘤的理想体液，故而尿液中miRNAs的分析可能成为膀胱癌临床筛查的一个有应用前景的特征性指标。宫颈黏液也是一种理想的宫颈肿瘤定性材料，利用宫颈黏液进行综合微阵列分析，检测特异性miRNAs有可能成为宫颈癌及其前期病变的生物标志物。路武豪[6]在对28例喉咽鳞癌miRNAs表达调控研究中指出，HPV感染存在于咽喉鳞癌组织中，HPV阳性率为25%，HPV-16是最常见的感染类别。在HPV-16阳性喉咽鳞癌组织和转染HPV-16E6-E7基因的FaDu细胞中，表达显著上调的为miR-363、miR-15a，表达无明显变化为miR-155。

3 miRNAs水平与宫颈癌的发生与发展

Kawai等[7]在研究中探讨了四种miRNAs(miR-126-3p、miR-20b-5p、miR-451a和miR-144-3p)的表达水平与组织学、宫颈细胞学和HPV感染状况的关系。在组织学分析中，这些miRNAs的表达水平随着疾病严重程度的增加而显著升高。在癌前状态如CINⅡ级或CINⅢ级的病例中，miR-451a和miR-144-3p分别约增加16倍和26倍。细胞学上，这些miRNAs的价值随着上皮内病变阴性(NILM)、LSIL、HSIL和鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)等严重程度的增加而显著增加。HPV基因型方面，HPV16/18阳性组miR-126-3p、miR-20b-5p、miR-451a、miR-144-3p表达量最高，分别为2.3、4.0、27.3、61.0。通过检验校正，HPV阴性组与其他组相比有显著差异。

Kong等[8]的研究表明，CIN或宫颈癌患者血清中hsa-miR-92a的表达明显高于健康志愿者。晚期宫颈癌患者血清中hsa-miR-92a表达高于早期宫颈癌患者。ROC分析显示，hsa-mir-92a对CIN和宫颈癌的诊断截止值为1.52，敏感性为69.6%，特异性为80.4%，曲线下面积(AUC)为0.83。hsa-mir-92a上调与宫颈癌相关，血清hsa-mir-92a水平可作为宫颈癌诊断的独立标志物。

Tian等[9]通过对1021名HPV阳性患者的研究发现，miR-424、miR-375、miR-34a和miR-218在宫颈高级别CIN和异常细胞学中的表达均明显低于低级别CIN和正常细胞学。宫颈脱落细胞中miR-424或miR-375检测和基于miR-424、miR-375和miR-218的多标记板在高级别CIN鉴定方面优于Pap分级。miRNA的检测可能为HPV阳性的女性提供一个新的分类选择。

4 miRNAs与HPV的联合筛查

Martinez等[10]研究发现，HPV参与宫颈癌的发病机制。与正常宫颈相比，在含有完整HPV-16 DNA的宫颈细胞系中，有3个miRNA表达过度，24个表达不足。此外，与HPV阴性的宫颈癌细胞株C-33A相比，整合的HPV-16细胞株中有9个miRNA过表达。与C-33A和正常宫颈相比，miR-218在HPV阳性细胞株、宫颈病变和含有HPV-16 DNA的癌组织中特异性低表达。高危HPV-16的E6癌基因的表达降低了miR-218的表达，而低危HPV-6的E6癌基因的表达没有降低，相反，在HPV-16阳性细胞系中E6/E7癌基因的RNA干扰增加了miR-218的表达。证明上皮细胞特异性标记物LAMB 3是miR-218的靶点。其研究结果还表明，在HPV-16 E6致癌基因存在的情况下，LAMB 3的表达增加，这种作用是通过miR-218介导的。这些发现可能有助于更好地理解宫颈癌发生的分子机制。

Au等[11]研究结果显示，宫颈癌中miRNAs表达的异常与HPV的整合密切相关。在HPV相关性宫颈癌中，miR-23b经常是下调的。在宫颈癌中可检测到miR-23b靶点尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)，但在正常宫颈组织中没有检测到。因此，在HPV相关宫颈癌进展中，miR-23b和uPA的研究具有重要意义。有研究发现，高危亚型HPV-16 E6癌蛋白可降低miR-23b的表达，增加uPA的表达，从而诱导人宫颈癌SiHa和CaSki细胞迁移。uPA是miR-23b的靶基因，因为miR抑制uPA表达并与uPA mRNA的3’非翻译区相互作用。已知肿瘤抑制因子p53被HPV-16 E6灭活。miR-23b启动子区域检测到一致的p53结合位点，而p53反式激活并与miR的启动子相互作用。p53被认为介导了HPV-16 E6下调miR-23b。由此，miR-23b/uPA被证实参与HPV-16 e6相关宫颈癌的发生发展。

吕卫国等[12]研究揭示了中国女性人群HPV感染的新流行病学特征，发现中国女性HPV58、52感染率高于欧美地区，HPV52、58、56和16的持续感染率高于其他型别；首次发现了34个型内新变体，并确认亚洲人群的两种变体具有更高的致癌潜能，为HPV检测新技术的研发奠定了基础。首次发现miR29/375/424等多个miRNAs在HPV致癌过程中的作用并揭示其机制，为探寻精准筛查宫颈癌新的标记物夯实基础。

综上所述，miRNAs能够在宫颈上皮内瘤变及浸润性宫颈癌的宫颈脱落细胞中进行检测，提高了宫颈细胞学检测在HPV筛检阳性女性中的分层筛查价值。