HPLC法测定不同花色木本曼陀罗中莨菪碱和东莨菪碱含量

刘国宇，崔新爱，李艳，赵继香，王玮，周军辉

(1.陕西省西安植物园，陕西 西安 710061；2.陕西省植物资源保护与利用工程技术研究中心，陕西 西安 710061)

木本曼陀罗(BrugmansiaArborea)为茄科木本曼陀罗属常绿灌木或小乔木，常见有黄花、红花和白花3种花色。木本曼陀罗中含有莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)等托品烷类生物碱，在临床上主要用于治疗晕动症、胃肠痉挛性绞痛、帕金森症、戒除药物成瘾性等[1-2]。其中，东莨菪碱药效强，毒副作用较低，市场需求量大。目前，东莨菪碱的提取原料主要是洋金花[3]。有文献表明木本曼陀罗是少有的东莨菪碱优势资源植物[4-5]。本研究采用高效液相色谱(HPLC)法对3种花色木本曼陀罗各部位中莨菪碱和东莨菪碱含量进行测定，以期对寻找东莨菪碱优势资源植物提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

木本曼陀罗，采自陕西省西安植物园，采集时间为2017年12月4日，经陕西省西安植物园李艳研究员鉴定为木本曼陀罗BrugmansiaArborea；莨菪碱对照品(批号KA0802CB14，含量≥98%)，购自上海源叶生物科技有限公司；东莨菪碱对照品(批号17121229，含量≥98%)，购自上海同田生物技术股份有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯；氨水、乙醇、乙醚、硫酸、氯仿、氢氧化钠、磷酸钠、十二烷基硫酸钠、磷酸均为分析纯；水为实验室自制的超纯水。

Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪(配备LC-20AT双泵、SPD-M20A二极管阵列检测器、SIL-20A自动进样器、LabSolution工作站等，InertSustain C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱)；BT125D型电子天平；KQ5200DE型数控超声波清洗器；RV10基本型旋转蒸发仪；101A-2E电热鼓风干燥箱；UPH-Ⅱ-10T型超纯水机。

1.2 原料预处理

采集时，将木本曼陀罗的根、茎、叶、花等不同部位分开采集，阴干后置于50 ℃恒温烘箱内继续烘干，粉碎并过40目筛，密封保存，备用。

1.3 实验方法

1.3.1 对照品储备液的制备 分别精密称取对照品莨菪碱、东莨菪碱适量，用甲醇溶解并定容到刻度，得质量浓度分别为0.351，0.384 mg/mL的混合对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备[6]分别称取木本曼陀罗不同部位(包括根、茎、叶、花等)粉末约450 mg，精密称量后置于具塞的锥形瓶中，精准加入浓氨水-乙醇-乙醚(4∶5∶10)溶液45 mL，摇匀、密塞，室温放置12 h，常温下超声提取2次，每次30 min，用漏斗过滤，收集上清液，残渣用少许提取液洗涤2次，合并上清液与洗涤液，于60 ℃水浴上旋转蒸干。残渣用1 mL 浓度0.5 mol/L硫酸溶解(超声约1 min)，以8 000 r/min离心4 min后，收集上清液至分液漏斗，再用1 mL纯水超声洗涤，同样转速离心4 min，合并上清液到分液漏斗，用氯仿萃取3次(40，20，20 mL)，每次萃取后弃去氯仿层，水层用0.5 mol/L氢氧化钠调节pH至8～9，再用氯仿萃取3次(40，20，20 mL)，收集合并氯仿层，水浴蒸去氯仿，用甲醇溶解残渣，超声1 min，定容至5 mL，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

1.3.3 色谱条件[7]InertSustain C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.07 mol/L磷酸钠溶液(含0.017 5 mol/L十二烷基硫酸钠，用磷酸调节pH值至6.0)(50∶100)，流速1.0 mL/min，检测波长为216 nm，柱温35 ℃，进样量10 μL。混合对照品溶液和样品典型色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液(A)和样品(B)色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixtures reference substances(A)and sample(B)1.东莨菪碱；2.莨菪碱

2 结果与讨论

2.1 线性关系考察

2.2 精密度实验

精密吸取供试品溶液10 μL，依1.3.3节色谱条件进行测定，连续进样5次，记录莨菪碱、东莨菪碱的峰面积，计算RSD值分别为1.87%，1.06%，表明仪器精密度良好。

2.3 重复性实验

精密称取同一样品粉末5份，按1.3.2节方法制备供试品溶液，按1.3.3节色谱条件进行测定。计算莨菪碱和东莨菪碱的含量分别为0.036%和0.082%，RSD分别为1.79%和1.23%，表明方法的重复性良好。

2.4 稳定性实验

取同一供试品溶液，分别于制备后的0，5，10，15，20 h进样测定，记录莨菪碱和东莨菪碱的峰面积，计算RSD值分别为2.28%和1.26%，表明供试品溶液在20 h内稳定。

2.5 加样回收率实验

精密称取已知含量的白花木本曼陀罗种子粉末3份，每份约410 mg，分别精密加入莨菪碱和东莨菪碱混合对照品溶液适量，按1.3.2节方法制备供试品溶液，分别进样，测定并计算莨菪碱和东莨菪碱的加样回收率及RSD值，结果见表1。

表1 加样回收率实验结果(n=3)Table 1 Recoveries of hyoscyamine and scopolamine

2.6 样品含量测定

精密称取红、黄、白3种花色木本曼陀罗不同组织部位样品，按1.3.2节方法制备供试品溶液，按1.3.3节色谱条件进行测定，利用外标法计算莨菪碱和东莨菪碱含量，结果见表2。

表2 3种花色木本曼陀罗各部位中莨菪碱和东莨菪碱含量Table 2 The contents of hyoscyamine and scopolamine in different parts of 3 colorful Brugmansia Arborea

由表2可知，红花木本曼陀罗中莨菪碱含量的分布为主根>须根>花苞>嫩叶>花>地下茎>一年生木质化茎>多年生木质化茎>一年生非木质化茎>老叶，主根中含量最高，为0.066%；东莨菪碱含量分布为花苞>花>一年生非木质化茎>嫩叶>一年生木质化茎>主根>多年生木质化茎>老叶>须根>地下茎，花苞中含量最高，为0.114%。

黄花木本曼陀罗中莨菪碱含量分布为嫩叶>须根>花苞>一年生非木质化茎>花>多年生木质化茎>主根>老叶=一年生木质化茎>地下茎，嫩叶中含量最高，为0.156%；东莨菪碱含量分布为嫩叶>一年生非木质化茎>花>老叶>多年生木质化茎>须根>主根>花苞>一年生木质化茎>地下茎，嫩叶中含量最高，为0.287%。

白花木本曼陀罗中莨菪碱含量分布为花苞>主根>一年生木质化茎=须根>种子>花>多年生木质化茎=地下茎>嫩叶>老叶=一年生非木质化茎，花苞中含量最高，为0.058%；东莨菪碱含量分布为一年生木质化茎>种子>花>嫩叶>主根>老叶>多年生木质化茎=须根>一年生非木质化茎>花苞>地下茎，一年生木质化茎含量最高，为0.433%。

总体来看，不同花色木本曼陀罗以及各组织部位中莨菪碱和东莨菪碱含量差异较大。红花木本曼陀罗中东莨菪碱含量总体低于黄花和白花木本曼陀罗，主根和须根中莨菪碱含量略高于东莨菪碱，其他部位以及黄花和白花木本曼陀罗的各部位中东莨菪碱含量都显著高于莨菪碱含量，而常见的托品烷类生物碱来源植物中莨菪碱含量高于东莨菪碱[8-10]。可见，木本曼陀罗是东莨菪碱优势资源植物。白花木本曼陀罗一年生木质化茎中东莨菪碱含量最高，且植株生长量大，可以考虑作为大量提取东莨菪碱的主要原材料，种子中含量也较高，但由于种子的产量受气候及自身生长影响较大，不适合作为大量工业生产的原料。由于黄花木本曼陀罗抗性强、生物产量较大，东莨菪碱含量较高，有必要以嫩叶、一年生非木质化茎和花作为工业提取东莨菪碱的原料进一步研究。

3 结论

本实验测定了3种不同花色木本曼陀罗各组织部位中莨菪碱和东莨菪碱含量分布，进一步确定了木本曼陀罗是东莨菪碱优势资源植物，更准确清晰地指导木本曼陀罗的采收部位，为木本曼陀罗作为东莨菪碱资源植物的开发利用提供了理论参考。